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吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 湖南吉首 416000

純種發(fā)酵技術(shù)已成為現(xiàn)代發(fā)酵肉制品加工中的重要技術(shù)手段，它能顯著提高發(fā)酵肉產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌在發(fā)酵肉制品加工中起著產(chǎn)香、促進(jìn)發(fā)色和提高發(fā)酵肉制品安全性等重要作用，被認(rèn)為是發(fā)酵肉中的功能性微生物成分[2]。肉葡萄糖球菌與木糖葡萄球菌是發(fā)酵肉制品中，受到關(guān)注和應(yīng)用最廣泛的兩種菌[3～5]，它們在發(fā)酵肉制品的低溫腌制過程中生長緩慢，而在烘烤過程中又會由于高溫而失活。迄今仍未見有適用于發(fā)酵肉用的耐高溫產(chǎn)香葡萄球菌的分離、純化和鑒定的研究報(bào)道。使用包含耐高溫產(chǎn)香葡萄球菌在內(nèi)的純種發(fā)酵技術(shù)，有望縮短發(fā)酵肉的生產(chǎn)時(shí)間，提高產(chǎn)品質(zhì)量。因此，本文從湘西土家臘肉中進(jìn)行耐高溫葡萄球菌的篩選、分離純化和鑒定，希望獲得能用于發(fā)酵肉的耐高溫葡萄球菌優(yōu)良菌種，為發(fā)酵肉加工新工藝的開發(fā)和發(fā)酵肉制品質(zhì)量與安全的提高，提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

湘西臘肉，湘西農(nóng)戶家收購；

伊利脫脂奶粉和全脂奶粉，內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；

干酪素，西隴化工廠；

精氨酸等氨基酸，Biosharp公司；

牛肉浸膏、蛋白胨、D-甘露醇等，國藥集團(tuán)；

耐熱脫氧核糖核酸酶培養(yǎng)基、細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定管，杭州濱和微生物公司。

SPX-250B-Z恒溫生化培養(yǎng)箱、YXQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅器，上海博訊實(shí)業(yè)公司；

VS-1300L-U超凈臺，蘇州安泰空氣技術(shù)公司；

BA210生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

各種微生物培養(yǎng)和檢測培養(yǎng)基等按照參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行配制。

1.2.2 菌株的分離純化

取10.0g絞碎臘肉加于90.0mL無菌蛋白胨水中，200r/min水浴搖床震蕩60min，然后靜置1h，取樣在MSA液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h后，再取樣在MSA固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24h。挑取符合葡萄球菌特征的單菌落用平板劃線法純化。純化后鏡檢，并對純菌種做革蘭氏染色以及細(xì)胞形態(tài)等檢驗(yàn)。

1.2.3 耐高溫葡萄球菌優(yōu)質(zhì)菌株的篩選路線

在MSA瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌株→50℃培養(yǎng)篩選→革蘭氏染色陽性、球狀、過氧化氫酶陽性實(shí)驗(yàn)→不產(chǎn)粘液→呋喃唑酮敏感性試驗(yàn)→進(jìn)行發(fā)酵劑基本要求實(shí)驗(yàn)(不產(chǎn)色素，耐酸，不分解精氨酸，不產(chǎn)生物胺)→符合產(chǎn)香基本要求實(shí)驗(yàn)(可分解蛋白質(zhì)、脂肪)→硝酸鹽還原酶檢測(挑選紅圈直徑大于1.2cm的菌株)→產(chǎn)香感官檢驗(yàn)→菌株安全性檢測(凝固酶、耐熱核酸酶的檢測，溶血試驗(yàn))→菌株鑒定。

1.2.4 菌株的篩選方法

(1)過氧化氫酶陽性實(shí)驗(yàn)。

取50℃培養(yǎng)24h后的菌體溶于有5%過氧化氫的載玻片上，產(chǎn)氣泡為陽性結(jié)果，反之為陰性結(jié)果。

(2)產(chǎn)粘性實(shí)驗(yàn)。

菌株50℃培養(yǎng)24h后用接種針挑取菌落觀察粘性情況。

(3)呋喃唑酮敏感性實(shí)驗(yàn)。

把培養(yǎng)18h的菌體涂在MSA平板，將100μg/片的呋喃唑酮貼在平板上，50℃培養(yǎng)24h觀察，出現(xiàn)抑菌圈者為葡萄球菌。

(4)產(chǎn)色素的檢測。

MSA培養(yǎng)基上添加30%的滅菌全脂奶粉，然后接種菌株并于50℃培養(yǎng)24h，再于室溫下培養(yǎng)3d，觀察色素產(chǎn)生情況。

(5)耐酸性檢測。

將菌種接種于pH值5.5的MSA液體培養(yǎng)基，50℃培養(yǎng)24h后看肉湯是否渾濁。

(6)分解精氨酸的檢測。

在精氨酸發(fā)酵管和對照管中接種，用無菌液體石蠟封住培養(yǎng)基液面，陽性結(jié)果判定依據(jù)為：實(shí)驗(yàn)管為紫紅色，對照管為黃色。若兩管均為黃色，結(jié)果為陰性。

(7)生物胺的檢測。

在氨基酸發(fā)酵管和對照管中，用無菌液體石蠟封住培養(yǎng)基液面，37℃培養(yǎng)18～24h，陽性結(jié)果判定依據(jù)為：實(shí)驗(yàn)管為紫紅色，對照管為黃色，為陽性；若兩管均為黃色，結(jié)果為陰性。

(8)蛋白酶活性檢測。

分別在脫脂奶粉(SM)培養(yǎng)基和酪蛋白(CA)培養(yǎng)基上接種，30℃培養(yǎng)5d后觀察兩種培養(yǎng)基上菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，CA培養(yǎng)基上需滴加10%的三氯乙酸。

(9)脂肪酶活性檢測。

在脂肪酶檢測平板上30℃培養(yǎng)5d后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈。

(10)硝酸鹽還原酶活性

在硝酸鹽還原酶檢測平板上50℃培養(yǎng)8h，向平板傾倒培養(yǎng)基等量的GriesS試劑，傾倒溶液后觀察菌落周圍是否呈現(xiàn)紅圈。

(11)產(chǎn)香感官檢測。

將菌株活化兩次，再分別等量接種于肉浸汁肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10d，以不接菌的空白肉湯培養(yǎng)基為對照，由5人感官評價(jià)其香氣產(chǎn)生狀況，挑選出有濃郁水果香味的菌株，進(jìn)行菌株的安全性檢測。

1.2.5 安全性檢測

(1)凝固酶的檢測。

取2.5mL的兔血漿稀釋液與0.5mL新鮮葡萄球菌培養(yǎng)液混合，在50℃培養(yǎng)1h和4h后觀察結(jié)果，出現(xiàn)膠狀或固狀的凝塊為陽性，纖維狀為弱陽性。用金黃色葡萄球菌作對照。

(2)耐熱核酸酶的檢測。

將新鮮培養(yǎng)的菌株傾注到DNA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h后，出現(xiàn)紅色為陽性。

(3)溶血試驗(yàn)。

取一小環(huán)菌體在血平板上劃線，于37℃培養(yǎng)24、48、72h后觀察結(jié)果，出現(xiàn)溶血圈者為陽性結(jié)果。用金黃色葡萄球菌作對照。

1.2.6 菌種鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定。

觀察培養(yǎng)基上菌落的形狀、顏色、大小等形態(tài)特征并將純菌株G染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞的形態(tài)。

(2)菌株的生理生化鑒定。

將篩選得到的菌株接種于微量生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)18～72h，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填寫在生化鑒定單上，并得出相應(yīng)的編碼值，檢索細(xì)菌生化鑒定編碼表，鑒定到種。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的分離純化

采用MSA培養(yǎng)基，將臘肉樣品的肉湯懸濁液進(jìn)行涂布、劃線培養(yǎng)后，得到38株分離的單菌落，標(biāo)記為S1～S38。圖1、圖2分別為涂布培養(yǎng)和劃線培養(yǎng)結(jié)果。

2.2 葡萄球菌的初篩

對S1～S38革蘭氏染色及鏡檢、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為G+、球形、過氧化氫酶陽性，可能為微球菌或葡萄球菌。

2.3 葡萄球菌的復(fù)篩

對初篩得到的38株菌株進(jìn)行產(chǎn)粘液、呋喃唑酮、產(chǎn)色素、耐酸、分解精氨酸、產(chǎn)生物胺、分解蛋白質(zhì)和脂肪、硝酸鹽還原酶、產(chǎn)香感官等實(shí)驗(yàn)，以得到不產(chǎn)粘液、不產(chǎn)色素、耐酸、不產(chǎn)生物胺、可分解蛋白質(zhì)和脂肪、產(chǎn)硝酸鹽還原酶、產(chǎn)香的葡萄球菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

圖1 葡萄球菌涂布培養(yǎng)

圖2 葡萄球菌劃線培養(yǎng)

葡萄球菌如果產(chǎn)粘液狀的代謝產(chǎn)物，會不利于發(fā)酵肉制品的感官和組織狀態(tài)。表1顯示，38株菌株在產(chǎn)粘液實(shí)驗(yàn)中，僅有S2、S4、S5、S6、S9、S10、S11、S12、S15、S16、S17、S19、S20、S21、S22、S23、S25、S26、S28、S29、S30、S32、S33、S35、S36共25株不產(chǎn)粘液，因此對它們進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

在呋喃唑酮敏感性實(shí)驗(yàn)中，以上25株菌株均出現(xiàn)大于15mm的抑菌圈，說明這25株菌株為葡萄球菌，而非微球菌。圖3為其中S10菌株的呋喃唑酮敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

同樣，葡萄球菌不能產(chǎn)有顏色的代謝產(chǎn)物，否則會影響發(fā)酵肉制品的色澤。在產(chǎn)色素試驗(yàn)中，有S4、S5、S9、S10、S19、S20、S21、S25、S28、S29共10株不產(chǎn)色素，因此對它們開展下一步的實(shí)驗(yàn)。圖4為其中S20菌株的產(chǎn)色素實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 葡萄球菌篩選項(xiàng)目及結(jié)果

注：表中“+”為陽性，“-”為陰性。

發(fā)酵肉制品生產(chǎn)用葡萄球菌發(fā)酵劑需能耐受乳酸菌所產(chǎn)生的酸性環(huán)境[7]。在耐酸性實(shí)驗(yàn)中，以上10株菌株均呈現(xiàn)耐酸性，如圖5所示，培養(yǎng)液中有渾濁物生成，代表有菌株生長。

圖3 呋喃唑酮敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 菌株S20產(chǎn)色素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 分解精氨酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在分解精氨酸實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，S4、S5、S9、S10、S20、S28、S29這7株菌株不分解精氨酸，說明這些菌株不會產(chǎn)生脫氨酶，不會因產(chǎn)生氨氣而影響發(fā)酵肉制品的風(fēng)味。圖6為其中S20菌株的精氨酸檢測結(jié)果，試驗(yàn)管和對照管均變?yōu)辄S色。

圖7 產(chǎn)生物胺檢測結(jié)果

圖8 蛋白質(zhì)分解檢測結(jié)果

生物胺是一些有機(jī)堿性含氮小分子化合物，它們在植物、動物、微生物細(xì)胞中都存在，具有一定的生理活性。而在發(fā)酵食品中，一些微生物對某些游離氨基酸作用會產(chǎn)生大量生物堿。過多攝入生物堿則會給人體健康帶來嚴(yán)重問題[8]。因此，肉制品發(fā)酵劑不能不產(chǎn)生物胺。在生物胺實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，S4、S5、S9、S10、S20這5株菌株不產(chǎn)生物胺。圖7為其中S5菌株的生物胺檢測結(jié)果，所有試管均變?yōu)辄S色。

發(fā)酵肉制品中滋味成分和揮發(fā)性風(fēng)味成分的形成主要依靠蛋白質(zhì)和脂肪的分解和氧化，因此發(fā)酵劑需要具有一定的分解蛋白質(zhì)和脂肪的能力[9]。在蛋白質(zhì)和脂肪分解實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，S5、S9、S10、S20這4株菌株均可分解蛋白質(zhì)和脂肪。圖8為其中S9菌株的分解蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖9為其中S4菌株的分解脂肪實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖9 脂肪分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖10 硝酸鹽還原酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在硝酸還原酶活性實(shí)驗(yàn)中，以上4種菌株的紅圈都大于1.2cm，說明4種菌株都具有硝酸鹽還原能力，具有在發(fā)酵肉制品加工中發(fā)色和產(chǎn)風(fēng)味的作用[10]。圖10為其中S5菌株的硝酸鹽還原酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

微生物菌株的種類與發(fā)酵肉制品的揮發(fā)性風(fēng)味的形成有密切的關(guān)系[11]。在感官分析實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以上4種菌株均有濃郁的水果香味，其中以S5最為突出。

圖11 耐熱核酸酶檢測結(jié)果

溶血素、凝固酶、耐熱核酸酶是致病性葡萄球菌的毒力因子[12]。對分離篩選到的4株葡萄球菌的安全性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)凝固酶、耐熱核酸酶、溶血性實(shí)驗(yàn)全部為陰性，這說明分離到的葡萄球菌是安全的。圖11為耐熱核酸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上可知，分離得到的菌株中65.8%菌株不產(chǎn)粘液，26.3%菌株不產(chǎn)色素并耐酸，18.4%菌株不分解精氨酸，13.2%菌株不產(chǎn)生物胺，10.5%菌株具有分解蛋白質(zhì)、脂肪和硝酸鹽還原能力，并產(chǎn)濃郁水果香味，即S5、S9、S10、S20這4株葡萄球菌。對這4株菌株進(jìn)行安全性分析，表明這4株菌株可安全使用。

2.4 菌株的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征

2.4.1 形態(tài)學(xué)特征

對菌株S5、S9、S10、S20進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在MSA固體培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)2d后，菌落為白色，圓形，中央凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊，菌落直徑約lmm；在液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24h，細(xì)菌生長迅速，到達(dá)最大濁度后菌體緩慢沉淀至試管底部，菌體呈乳白色。顯微鏡下，細(xì)胞呈球狀，并團(tuán)塊狀或葡萄串狀排列。

2.4.2 菌株的生理生化鑒定

由形態(tài)學(xué)特征和表2結(jié)果，鑒定4種葡萄球菌分別為1株表皮葡萄球菌，2株華納氏葡萄球菌以及1株木糖葡萄球菌。

表2 葡萄球菌的生理生化鑒定結(jié)果

注：表中“+”為陽性，“-”為陰性。

3 結(jié)論

從湘西傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中篩選到4株優(yōu)良產(chǎn)香耐高溫葡萄球，鑒定結(jié)果為1株表皮葡萄球菌，2株華納氏葡萄球菌以及1株木糖葡萄球菌。4菌株的凝固酶、耐熱核酸酶、溶血安全性檢驗(yàn)結(jié)果皆為陰性，說明這些菌株有望安全地用于發(fā)酵肉制品加工中。