(1.天津科技大學,天津,300457；2.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750100)

我國紅棗產量占世界總產量的98%，產地廣泛分布于山西、陜西、寧夏、河北、新疆等地[1]。紅棗發(fā)酵酒是一種低酒精度、高營養(yǎng)價值的滋補飲品，以紅棗為原料，經過篩選、破碎、低溫發(fā)酵、陳釀、調制等工藝釀制而成[2]。棗渣是棗酒、棗汁生產過程中產生的含有水、細胞碎片和豐富膳食纖維的副產物[3]。近年來，利用廢棄物進行發(fā)酵來增加產品附加值已成為研究的熱點，如利用廢渣或廢棄木質纖維素等[4-5]。關于廢渣的研究，如對葡萄渣、刺梨果渣、馬鈴薯渣和柑橘皮渣的利用研究已有了一定的進展，但對棗渣的綜合利用的研究報道甚少[6-10]。酵母菌和乳酸菌作為益生菌不僅廣泛應用于單純發(fā)酵，還應用于以上各類廢渣的發(fā)酵中[11-13]。侯蓓等[14]使用棗渣為原料培養(yǎng)嗜酸乳桿菌，尋求嗜酸乳桿菌的工業(yè)化生產配方。乳酸菌和酵母菌作為常見發(fā)酵菌種，它們之間存在著穩(wěn)定的共生關系，這種可靠的關系使得微生物對于復雜的食品系統(tǒng)具有更高的適應性[15]。乳酸桿菌在發(fā)酵中起到產酸的作用，抑制雜菌生長的同時還能有效改善飼料的適口性。釀酒酵母在發(fā)酵過程中可以利用底物的營養(yǎng)成分短時間內合成菌體蛋白[16]。因此，利用這兩種菌種混合發(fā)酵既能夠發(fā)揮乳酸菌的益生和抑菌的作用[17]，還可以生產相應優(yōu)質蛋白。

筆者使用嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母菌作為發(fā)酵菌種，對棗渣進行發(fā)酵研究。對培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高單細胞蛋白含量，從而提高棗渣資源化利用價值，拓寬飼料原料來源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為試驗室自有菌種。

1.1.2 原料與試劑

棗渣，由寧夏盛康源紅棗酒業(yè)生物科技有限公司負責提供；玉米、麩皮均為公司正常批次采購；硫酸銨、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀為分析純級別試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵工藝及控制點

1) 主要原料處理：將除去核的棗渣在50 ℃下烘干48 h，粉碎，以m(棗渣)∶m(玉米)∶m(麩皮)=50∶20∶30比例混合均勻，過40目篩備用。

2) 輔助原料處理：將輔助原料以m(硫酸銨)：m(硫酸鎂)：m(磷酸二氫鉀)∶m(碳酸鈣)=1∶0.5∶1∶0.5的比例混合均勻，溶于100 g純化水中備用。

3) 發(fā)酵培養(yǎng)基配制：將主要原料和輔助原料以m(主要原料)∶m(輔助原料)=1∶1的比例混合均勻，116 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

4) 活化接種：將嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母菌進行傳代活化，至少傳代3代，將兩種菌液按m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1比例混合，再按每100 g培養(yǎng)基接種15 mL活化菌液的比例接入菌液。最后稱取100 g培養(yǎng)基裝入500 mL三角瓶中，充分混合均勻。

5) 發(fā)酵培養(yǎng)條件：在32 ℃恒溫的條件下，進行普通有氧發(fā)酵84 h，每隔12 h翻動一次。

6) 發(fā)酵產物處理：在45 ℃恒溫條件下，將發(fā)酵產物烘干至恒重，將烘干后的樣品用粉碎機粉碎后過40 目篩。

1.2.2 棗渣培養(yǎng)基主要成分分析

研究所用棗渣，屬于釀酒發(fā)酵后的剩余物，營養(yǎng)成分較低。為充分滿足微生物生長需求，培養(yǎng)基中必須添加適量的碳源、氮源、無機鹽、生長因子和水。因此，對棗渣培養(yǎng)基中的主要原材料進行水分、粗蛋白和總糖進行檢測分析，以確定添加比例。

1.2.3 菌種考察試驗

1) 混菌比例試驗

嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母的混合比例會影響到發(fā)酵的產物形成，需對其最適配比進行試驗考察，所使用的培養(yǎng)基中各成分為m(棗渣)∶m(玉米)∶m(麩皮)∶m(硫酸銨)∶m(碳酸鈣)∶m(硫酸鎂)∶m(磷酸二氫鉀)=50∶20∶30∶1.0∶0.6∶0.4∶1.5?；炀浔纫姳?。

表1 混菌配比Table 1 Mixed bacteria ratio

1～5號培養(yǎng)基按10%的接種量進行接種，絕對接種量為3×107cfu/mL，6號培養(yǎng)基接種量為0，每組3個平行，在發(fā)酵條件下培養(yǎng)并進行處理，檢測真蛋白質量分數。

2) 接種量試驗

以質量分數為5%，10%，15%，20%和25%的混菌接種量，分別接種至配制好的培養(yǎng)基中，每組3個平行，培養(yǎng)溫度32 ℃，恒溫培養(yǎng)時間84 h，對其真蛋白質量分數進行檢測。

1.2.4 培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

采用正交試驗，對培養(yǎng)基中4種無機鹽進行考察，以發(fā)酵產物的真蛋白質量分數為判斷依據，以確定最適合的培養(yǎng)基配方。

1.2.5 相關指標檢測方法

試驗中的粗蛋白的測定采用凱氏定氮法；水分檢測采用烘箱法；總糖的測定采用DNS法[18]；真蛋白的測定采用硫酸銅沉淀法[19]。

2 結果與分析

2.1 棗渣培養(yǎng)基主要成分分析結果

棗渣培養(yǎng)基各主要成分的質量分數見表2。

表2 棗渣培養(yǎng)基各主要成分的質量分數Table 2 Mass fraction of main components of the slag medium

由表2可知：棗渣中含有未被利用的營養(yǎng)物質，質量分數低是由于制酒過程中會消耗大量的糖和蛋白質，致使棗渣中的糖和蛋白質量分數偏低，適當添加其他輔料可有效補充不足。添加玉米和麩皮能有效提高可利用糖質量分數。

2.2 菌種考察試驗

2.2.1 混菌比例試驗

混菌比例對真蛋白質量分數的影響見圖1。

圖1 混菌比例對真蛋白質量分數的影響Fig.1 Effect of mixed bacteria ratio on true protein content

由圖1可看出：隨著釀酒酵母配比的提高，真蛋白的質量分數明顯提高，5號配比中，當m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1時，產物中的真蛋白的質量分數最高，質量分數達到15.45%；4號培養(yǎng)基中當m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1時，產物中真蛋白質量分數也達到15.13%。試驗結果表明：釀酒酵母才是影響真蛋白質量分數的主要因素,而嗜酸乳酸桿菌的影響較小，釀酒酵母與嗜酸乳桿菌的最佳混菌質量比例為m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1。

2.2.2 接種量對真蛋白質量分數的影響

接種量對真蛋白質量分數的影響見圖2。

圖2 接種量對真蛋白質量分數的影響Fig.2 Effect of inoculum size on true protein content

由圖2可看出：在一定范圍內，接種量與真蛋白質量分數成正比，當接種量達到20%時，真蛋白質量分數呈下降趨勢，這可能是由于接種量過高，菌種生長較快，出現了抑制作用。當混菌接種量為15%時，發(fā)酵產物中真蛋白質量分數最高，達到15.58%。試驗結果表明：在相同條件下，最適的混菌接種量為15%。

2.3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗

在最適混菌比例和接種量條件下，對硫酸銨、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀4個影響因素進行正交試驗驗證，培養(yǎng)基配方因素水平見表3，正交試驗結果見表4,正交試驗方差分析見表5。

表3 培養(yǎng)基配方L1645正交試驗因素水平表Table 3 Medium formula L1645 orthogonal test factor level table

表4 培養(yǎng)基配方L1645正交試驗方案及結果

表5 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗方差分析表Table 5 Medium optimization orthogonal test variance analysis

注：*表示影響較顯著。

表3中的K值是同一因素某一水平試驗條件下，真蛋白的質量分數檢測結果平均值，其下標為對應的水平代碼。R表示同一因素不同水平試驗條件下，真蛋白的質量分數檢測結果的極差，其值代表著某一因素對真蛋白質量分數增加的影響程度。S值表示同一因素的偏差平方和，對其進行顯著性檢驗，得到F值。查F分布數值表得到Fa值，通過比較F與Fa值大小，以確定各因素的顯著性。

由表4，5可以看出：硫酸銨影響最顯著，主次因素順序為硫酸銨>磷酸二氫鉀>硫酸鎂>碳酸鈣。由表4中的K值，可以比較出同一因素不同水平對真蛋白質量分數影響的程度，從而得出最優(yōu)組合為A2B3C4D3。由于最優(yōu)配方組合沒有含在表3的16組試驗中，另外進行驗證試驗，驗證試驗結果真蛋白的質量分數為16.1%，高于表3中最佳組合A2B3C4D2的結果。

2.4 發(fā)酵前后棗渣蛋白質含量變化情況

綜上所述，使用最適培養(yǎng)基配方，其各組分的質量比為：m(棗渣)∶m(玉米)∶，m(麩皮)∶m(硫酸銨)∶m(碳酸鈣)∶m(硫酸鎂)∶m(磷酸二氫鉀)=50∶20∶30∶1.0∶0.6∶0.4∶1.5；在培養(yǎng)溫度為32 ℃的條件下發(fā)酵84 h，發(fā)酵前后的真蛋白質量分數檢測結果見表6。

表6 發(fā)酵前后棗渣真蛋白質量分數

由表6可知：使用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌混合菌進行固態(tài)發(fā)酵棗渣，產物真蛋白質量分數變化比較明顯，發(fā)酵后比發(fā)酵前提高了5.38%。

3 結 論

筆者采用固體發(fā)酵技術，利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對棗渣進行發(fā)酵培養(yǎng)，試驗最終確定了最佳發(fā)酵工藝為m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1，活化菌液的接種量為15%，培養(yǎng)基各成分最佳質量配比為m(棗渣)∶m(玉米)∶m(麩皮)∶m(硫酸銨)∶m(碳酸鈣)∶m(硫酸鎂)∶m(磷酸二氫鉀)=50∶20∶30∶1.0∶0.6∶0.4∶1.5。在32 ℃的恒溫培養(yǎng)條件下，發(fā)酵84 h后，發(fā)酵產物的真蛋白質量分數為16.1%，比發(fā)酵前提高了5.38%。利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對廢棄棗渣進行生物發(fā)酵處理，明顯的提高了廢棄棗渣的飼用價值。