劉兆強(qiáng)，朱立國(guó)

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 骨科，陜西 咸陽(yáng) 712046

引言

骨再生由一系列協(xié)調(diào)的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)的生物過(guò)程所組成，環(huán)境條件和底物之間的相互作用形成破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的平衡[1]。骨再生在臨床領(lǐng)域進(jìn)行了大量的體外和體內(nèi)研究，涉及許多生物學(xué)過(guò)程，如破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的相互作用，成骨分化，骨的刺激作用，細(xì)胞生長(zhǎng)，信號(hào)通路和骨生長(zhǎng)因子等生物過(guò)程[2]。生物材料在體內(nèi)應(yīng)具有生物穩(wěn)定性和生物相容性，并且不會(huì)引起免疫反應(yīng)。我們臨床上常用的材料包括聚合物、金屬和碳基陶瓷，但是這些材料出現(xiàn)機(jī)械性能差、生物相容性低、與人體組織粘附性差等缺點(diǎn)[3]。我們?yōu)榱丝朔@些問(wèn)題，利用天然人骨中豐富的磷酸鈣基陶瓷作為生物材料。據(jù)報(bào)道，磷酸鈣具有骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特性，它們有助于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，因此，許多人對(duì)磷酸鈣用于骨再生進(jìn)行了研究[4]。我們將通過(guò)研究磷酸鈣的生物活性和骨再生應(yīng)用來(lái)總結(jié)使用磷酸鈣的骨再生策略。

1 磷酸鈣的生物活性

磷酸鈣是由鈣陽(yáng)離子和磷酸鹽陰離子組成的礦物質(zhì)，人體中60%無(wú)機(jī)材料都含有磷酸鈣。自20世紀(jì)以來(lái)，人工合成的磷酸鈣被大范圍的用于骨再生的臨床研究，此后，出現(xiàn)了大量骨再生應(yīng)用如骨水泥、支架、植入材料和磷酸鈣的涂層等，一些已經(jīng)商業(yè)化[5]。

為了確保生命系統(tǒng)和組織不應(yīng)發(fā)生炎癥或反應(yīng)排斥，每種可植入材料必須具有生物相容性，而研究發(fā)現(xiàn)磷酸鈣具有生物相容性，可能是因?yàn)樗鼈兛梢匀芙庠隗w液中，并以固體形式大量存在[6]。磷酸鈣的性質(zhì)影響生物活性，如成骨細(xì)胞的粘附、增殖和新骨形成，而降解和釋放磷酸鈣離子對(duì)于呈現(xiàn)這些生物活性特征是非常重要的，這種情況增加了鈣和磷酸根離子的局部濃度進(jìn)而刺激骨礦物質(zhì)在磷酸鈣表面的形成[7]。它們還影響成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)，如COL1、ALP、BMPs、OPN、OCN、BSP、ON和RunX2[8]。磷酸鈣通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在表面的吸附作用，進(jìn)而在細(xì)胞粘附和組織形成中發(fā)揮重要作用，也通過(guò)影響新形成的骨礦物來(lái)影響骨再生[9]。

鈣離子在幾個(gè)方面影響細(xì)胞和生命系統(tǒng)，因?yàn)樗切纬晒腔|(zhì)的離子之一和骨組織中多以磷酸鈣的形式存在[10]。這些鈣離子通過(guò)鈣化作用引起骨的形成和成熟并且還通過(guò)細(xì)胞信號(hào)影響骨再生，機(jī)制是它通過(guò)一氧化氮的形成刺激成熟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)前體細(xì)胞進(jìn)行骨組織再生[11]。鈣離子還通過(guò)激活ERK1/2刺激成骨細(xì)胞骨合成途徑，并通過(guò)激活PI3K/Akt途徑延長(zhǎng)成骨細(xì)胞的壽命[12]。此外，鈣離子還具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和吸收功能[13]。

磷離子大量存在于人體內(nèi)并與蛋白質(zhì)、核酸、三磷酸腺苷等多種物質(zhì)有關(guān)，影響著人的正常生理過(guò)程，超過(guò)80%的磷離子以磷酸鈣的形式與鈣離子一起存在于骨中[14]。磷酸鹽（PO43-）對(duì)組織形成和生長(zhǎng)有很大影響，如磷酸鹽通過(guò) IGF-1和ERK1/2通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)并增加BMPs的表達(dá)[15]。此外，磷酸在RANK配體及其受體信號(hào)之間具有負(fù)反饋?zhàn)饔?，并調(diào)節(jié)RANK配體：OPG的比率以抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收[16]。

磷酸鈣的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)特性對(duì)于骨再生也很重要。骨誘導(dǎo)是誘導(dǎo)祖細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞譜系的能力，而骨傳導(dǎo)是骨骼生長(zhǎng)在材料表面的能力而骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)都支持細(xì)胞粘附和增殖[17]。細(xì)胞粘附力受細(xì)胞外基質(zhì)蛋白吸附能力的強(qiáng)烈影響也受磷酸鈣表面特性如表面粗糙度、結(jié)晶度、溶解性、相含量、孔隙率和表面能的影響[18]。

骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)受表面化學(xué)和表面電荷的影響，如它們影響蛋白質(zhì)吸附并且通過(guò)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用發(fā)生成骨細(xì)胞分化[19]。磷酸鈣晶體結(jié)構(gòu)的粒度和粒徑?jīng)Q定它的作用，粗糙度影響磷酸鈣表面蛋白質(zhì)粘附和細(xì)胞粘附，而蛋白質(zhì)粘附性在粗糙度小于100 nm時(shí)得到加強(qiáng)[20]。

磷酸鈣的孔隙率對(duì)生物活性也有影響?？紫堵实脑黾痈纳屏似渑c表面區(qū)域上的體液的接觸導(dǎo)致溶解速率增加[21]。當(dāng)磷酸鈣的孔徑為20～500 μm時(shí)，蛋白質(zhì)吸附增強(qiáng)并且隨著孔數(shù)的增加吸附也會(huì)增強(qiáng)，孔徑大于100 μm會(huì)影響磷酸鈣的機(jī)械強(qiáng)度和形狀[22]。由于孔隙存在，磷酸鈣具有高脆性，低抗沖擊性和低拉伸應(yīng)力等機(jī)械性能，其抗壓強(qiáng)度優(yōu)于天然人骨，可以用于非承重植入物，缺陷填充等[23]。

親水性是成骨調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵因素，形成的親水表面對(duì)細(xì)胞吸附至關(guān)重要，可增加成纖維細(xì)胞的反應(yīng)，還可以增加骨細(xì)胞的成熟、分化以及骨整合并影響著細(xì)胞反應(yīng)[24]。此外，表面親水性增加了成骨細(xì)胞的粘附和增殖[25]。

磷酸鈣的溶解過(guò)程受每單位體積表面積，流體對(duì)流，酸度和溫度的影響。這決定了磷酸鈣的穩(wěn)定性和溶解性，通常溶解度與Ca/P離子的比例，純度，晶體大小和表面積成反比[26]。穩(wěn)定且低溶解度的磷酸鈣顯示出與其周圍環(huán)境的低離子交換和表面上的緩慢再結(jié)晶，從而通過(guò)帶電位點(diǎn)處的靜電相互作用確定蛋白質(zhì)濃度和構(gòu)象。另一方面，具有高溶解度的磷酸鈣容易改變局部pH和離子濃度，從而影響蛋白質(zhì)粘附[27]。

2 磷酸鈣的類型

磷酸鈣的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性來(lái)自其物理/化學(xué)特性，因此控制這些特性并選擇具有適合特定應(yīng)用的性質(zhì)的磷酸鈣是非常重要的，磷酸鈣的類型如圖1。

圖1 各晶體結(jié)構(gòu)示意圖

2.1 羥基磷灰石

羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HAP）廣泛用于骨再生，是一種天然形式的磷酸鈣，構(gòu)成人體骨骼中最大量的無(wú)機(jī)成分。HAP是天然形成的并且可以被收集，但是形成的結(jié)構(gòu)有缺陷，因此我們?cè)趯?shí)際研究或臨床應(yīng)用中使用的HAP是通過(guò)在水溶液系統(tǒng)中合成獲得的[28]。HAP是最穩(wěn)定的磷酸鈣，在溫度、pH、體液等生理環(huán)境中具有低溶解度，其表面可作為體液中骨礦物質(zhì)的成核位點(diǎn)，此外HAP在臨床應(yīng)用時(shí)不會(huì)引起炎癥反應(yīng)[29]。

HAP具有骨傳導(dǎo)性，但不具有骨誘導(dǎo)性。我們?yōu)榱俗屗哂形覀兿胍墓δ埽梢允褂梅?、氯、碳酸根離子等離子進(jìn)行替代達(dá)到我們的目的。例如，使用氟化物作為陰離子取代增加了它的穩(wěn)定性，使用鎂作為陽(yáng)離子取代增加了它的生物效應(yīng)[30]。

HAP在骨再生中的臨床應(yīng)用研究始于20世紀(jì)80年代中期，主要用于種植體涂層和移植材料。盡管HAP已被用于臨床應(yīng)用，但由于其獨(dú)特的硬脆特性，尚未用于高負(fù)荷的組織，主要用作涂層[31]。例如，金屬植入物表面上的涂層改善了成骨細(xì)胞活性和植入物的生物相容性和生物活性。我們通過(guò)將HAP與諸如聚合物的軟材料混合來(lái)進(jìn)行骨再生應(yīng)用的研究，控制孔隙率，機(jī)械強(qiáng)度，生物活性和易用性來(lái)進(jìn)行合成支架的研究等[32]。

2.2 磷酸三鈣

磷酸三鈣（Tricalcium Phosphate，TCP）是目前研究最多的磷酸鈣之一，Ca/P比為1.5，分為α相和β相，α-TCP具有單斜晶系空間群的晶體結(jié)構(gòu)，β-TCP具有菱形空間群的晶體結(jié)構(gòu)，α-TCP可以在1125℃或更高溫度下形成，β-TCP在900℃～1100℃的溫度下形成[33]。 β-TCP具有比α-TCP更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更高的生物降解速率，因此β-TCP通常用于骨再生，而β-TCP不如HAP穩(wěn)定，但具有更快的降解速率、更高的溶解度和高吸收率，廣泛用于提高生物相容性[34]。β-TCP的納米多孔結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的生物礦化和細(xì)胞粘附，以至于它能促進(jìn)骨形成細(xì)胞如成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，目前β-TCP已被用于骨再生、骨水泥和骨替代[35]。

2.3 白磷鈣石

白磷鈣石（Whitlockite，WH）是一種含有鎂離子的磷酸鈣，它是人體骨骼中第二豐富的礦物質(zhì)，它的Ca/P比為1.43，具有菱形空間群的晶體結(jié)構(gòu)。WH在酸性條件下（pH＜4.2）具有高穩(wěn)定性并且表面帶負(fù)電荷，與HAP相比，它表現(xiàn)出更高的抗壓強(qiáng)度，而且它的溶解度在生理?xiàng)l件下更高，并且可以連續(xù)釋放更多的離子[36]。

以前WH合成非常困難，因此WH的研究進(jìn)展不順利。最近研究發(fā)現(xiàn)，WH可以很容易地在低溫條件下合成，當(dāng)Mg離子存在于含有磷酸鈣的酸性溶液中時(shí)，就會(huì)形成WH。此外，當(dāng)破骨細(xì)胞再吸收老骨時(shí)，通過(guò)酸性分子的釋放，在酸性條件下發(fā)生WH的體內(nèi)合成，WH誘導(dǎo)的成骨基因的表達(dá)高于HAP和β-TCP[37]。此外，復(fù)合水凝膠大鼠顱骨缺損模型的體內(nèi)骨再生顯示W(wǎng)H促進(jìn)生長(zhǎng)和成骨活性優(yōu)于HAP。這些結(jié)果表明鎂和磷酸根離子的連續(xù)釋放通過(guò)控制成骨分化促進(jìn)骨生長(zhǎng)，特別是鎂離子似乎會(huì)增加骨形成，因?yàn)樗诮档推乒羌?xì)胞的活性中發(fā)揮作用[38]。最近研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)WH和HAP以約1:3的比例共存時(shí)，成骨活性增加，WH的高成骨活性及其在天然骨中的作用預(yù)計(jì)將有助于未來(lái)對(duì)磷酸鈣材料的研究[39]。

3 磷酸鈣的應(yīng)用

盡管磷酸鈣作為原料本身已廣泛用于骨科，但許多研究者通過(guò)把磷酸鈣進(jìn)行加工以便更好地利用。它可以用作改善骨植入物生物活性的涂層材料，還被用作生物材料的復(fù)合材料，以改變機(jī)械性能、控制生物降解和包封藥物（圖2）。

圖2 基于磷酸鈣的應(yīng)用

3.1 涂層

磷酸鈣涂層可以應(yīng)用于各種材料以增強(qiáng)生物活性，主要使用溶膠-凝膠和電沉積方法進(jìn)行制備，它的研究主要針對(duì)金屬植入物應(yīng)用，目的是為了防止植入物腐蝕和提高生物活性[40]。有人在研究多孔和網(wǎng)狀磷酸鈣涂在鎂合金表面上的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，這種涂層技術(shù)提高了生物活性，細(xì)胞相容性，骨傳導(dǎo)性和成骨作用。實(shí)驗(yàn)中將有該涂層的表面與常規(guī)鎂合金的表面進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)磷酸鈣包覆的鎂合金具有改善生物表面活性的作用。在成骨過(guò)程中，與未涂覆的鎂合金相比，觀察到骨生長(zhǎng)因子BMP-2和TGF-β1的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[41]。

有許多關(guān)于如何提高抗菌劑和生長(zhǎng)因子有效性的研究正在積極研發(fā)中。Zhou等[42]為了減少感染并改善細(xì)胞-材料相互作用和抗微生物活性，他們使用激光工程凈成形方法在Ti金屬表面上涂覆AgNO3和TCP。通過(guò)對(duì)人成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Ag-TCP包被的Ti顯示出細(xì)菌菌落的顯著減少。

3.2 骨水泥

磷酸鈣骨水泥主要用于填充和治愈骨缺損。骨水泥中主要摻入聚合物，如海藻酸鹽，甲殼素，殼聚糖，纖維素，明膠，膠原蛋白和合成聚合物，如聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG），聚乳酸-乙醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA))，聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）和聚左乳酸(Poly-L-lactic acid，PLLA)等物質(zhì)，作為這些聚合物的復(fù)合物，磷酸鈣粘固劑能夠控制諸如可注射性、孔隙率、機(jī)械性能和降解速率等性能[43]。Hesaraki等[44]研究磷酸鈣骨水泥發(fā)現(xiàn)其具有改善注射性和流動(dòng)性，可用于膀胱-腸內(nèi)反流疾病的尿道和骨缺損修復(fù)的微創(chuàng)手術(shù)，我們常將β-TCP糊劑與透明質(zhì)酸或PEG混合以制備磷酸鈣粘固劑。磷酸鈣粘固劑也存在一些問(wèn)題，如骨再生率和降解率之間的差異、孔徑導(dǎo)致的長(zhǎng)入限制、缺乏機(jī)械強(qiáng)度和合成聚合物的炎癥反應(yīng)。Ruhe等[45]研究了制備用于持續(xù)遞送重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）的PLGA和磷酸鈣復(fù)合物水泥，在該研究中，不同的pH和納米結(jié)構(gòu)條件下測(cè)量rhBMP-2釋放效應(yīng)發(fā)現(xiàn)該水泥可用于異位或原位部位的骨再生，Ohura等人制備磷酸一鈣一水合物（monocalcium phosphate monohydrate，MCPM）和β-TCP的混合水泥作為rhBMP-2的另一種載體時(shí)發(fā)現(xiàn)rhBMP-2移植的β-TCPMCPM作為rhBMP-2的載體對(duì)骨再生具有良好的效果。磷酸鈣骨水泥的脆性一直是磷酸鈣研究的一大難題，限制了它在臨床上非承重的應(yīng)用。Boehm等[46]通過(guò)對(duì)碳纖維表面進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)加固磷酸鈣骨水泥，發(fā)現(xiàn)它能夠改善它的彎曲強(qiáng)度和斷裂功能并且纖維增強(qiáng)不會(huì)影響 MG63（人成骨樣）細(xì)胞的細(xì)胞增殖和活性。使用化學(xué)修飾碳纖維增強(qiáng)磷酸鈣骨水泥是一種有前途的方法，可在這些骨水泥替代材料中獲得更好的力學(xué)性能，在一定程度上可用于承重應(yīng)用。

3.3 骨組織支架

磷酸鈣已經(jīng)與支架結(jié)合使用，如把藥物和生長(zhǎng)因子封裝在支架內(nèi)[47]。Koempel等[48]發(fā)現(xiàn)通過(guò)將rhBMP-2連接到大孔陶瓷HAP支架上可以促進(jìn)HAP在宿主骨中的整合。他將支架植入兔顱骨缺損模型中，并在四周后觀察骨形成程度發(fā)現(xiàn)負(fù)載rhBMP-2的植入物顯示出更有效的骨形成，還發(fā)現(xiàn)rhBMP-2增強(qiáng)了骨整合，使HAP支架保持在適當(dāng)位置，證實(shí)BMP負(fù)載于大孔磷酸鈣支架上可促進(jìn)新骨形成，防止移位，最大限度地減少宿主骨吸收，降低感染和擠出的發(fā)生率。Farré-Guasch等[49]研究發(fā)現(xiàn)在磷酸鈣支架上添加脂肪干細(xì)胞可以刺激成骨，骨誘導(dǎo)和血管形成，表明使用基質(zhì)血管部分接種磷酸鈣支架的促血管生成作用。

3.4 活性藥物載體

CaP移植材料或涂層是骨科在實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)中常用的藥物載體。研究發(fā)現(xiàn)在治療效率和耐受性方面，與全身治療相比，局部施用活性劑（藥物，蛋白質(zhì)，基因，細(xì)胞等）具有顯著優(yōu)勢(shì)[50]。骨組織的再生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要細(xì)胞因子、激素和生長(zhǎng)因子的參與下局部成骨。在骨感染、骨質(zhì)疏松或腫瘤發(fā)生等情況下，也需要抗生素、雙磷酸鹽以及抗腫瘤等藥物。

3.5 三維打印

3D打印是一種數(shù)字制造過(guò)程，其中幾何數(shù)據(jù)用于3D打印。支架結(jié)構(gòu)對(duì)骨再生至關(guān)重要，由于制造和材料科學(xué)的發(fā)展，客戶設(shè)計(jì)的具有微納米結(jié)構(gòu)的支架可以作為臨時(shí)基質(zhì)，為骨科手術(shù)中遇到的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育提供特定的環(huán)境和復(fù)雜的架構(gòu)。可以使用低溫或高溫3D打印的方法來(lái)制造CaP支架。在生物相關(guān)溫度下使用可改善印刷CaP支架機(jī)械性能的新型粘合劑或印刷技術(shù)是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域。一個(gè)典型的印刷CaP支架具有量身定制的機(jī)械性能和相互連接的孔隙率可以成為一個(gè)未來(lái)的骨再生植入材料。例如，Cox等[51]報(bào)道在使用HA和聚乙烯醇(PVOH)復(fù)合粉末的3D打印互聯(lián)多孔支架過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，HA：PVOH前體材料的流動(dòng)性會(huì)影響3D打印支架的機(jī)械穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)和孔隙率，并且燒結(jié)過(guò)程可以加強(qiáng)去除PVOH熱降解產(chǎn)物的能力和權(quán)衡抗壓強(qiáng)度。Ahlfeld等[52]使用一種穩(wěn)定的糊狀CaP水泥制備了一種3D打印的CaP支架，發(fā)現(xiàn)其作為可延展的糊劑穩(wěn)定并且僅在與水溶液接觸后才開(kāi)始固化反應(yīng)。后來(lái)他們?cè)跍睾偷臈l件下通過(guò)雙通道繪圖制作了一個(gè)含有磷酸鈣骨水泥糊劑和高濃度VEGF負(fù)載的海藻酸鹽基水凝膠糊劑的雙相支架。顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描顯示，即使在水凝膠鏈的膨脹狀態(tài)下，雙相支架內(nèi)也存在精確的鏈排列和相互連接的孔隙。雖然在控制支架結(jié)構(gòu)方面取得了可喜的結(jié)果，但3D打印CaP移植材料的臨床評(píng)價(jià)尚未獲得正式批準(zhǔn)，我們還需要更深入的臨床研究、架構(gòu)的優(yōu)化以及機(jī)械完整性、高制造成本、原材料的可行性和難以獲得監(jiān)管許可。不過(guò)，由于其在定制方面的意義，我們?nèi)钥梢詷?lè)觀地認(rèn)為3D打印CaP支架在不久的將來(lái)獲得許可。

4 總結(jié)

總之，磷酸鈣的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特征影響細(xì)胞粘附，增殖和新骨形成。生物活性可以通過(guò)離子釋放和磷酸鈣的物理性質(zhì)來(lái)改變和控制，離子釋放影響著成骨細(xì)胞、組織和生理過(guò)程，物理性質(zhì)影響蛋白質(zhì)/細(xì)胞吸收，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨整合。隨著人們對(duì)磷酸鈣工藝的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)其生物相容性研究的更加深入，相信磷酸鈣及其混合材料能為骨缺損和疾病的治療提供幫助。