(山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

生長素信號是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要途徑之一，它是細(xì)胞分裂、生長、分化、向性應(yīng)答和器官發(fā)育所必需的。生長素合成是調(diào)控植物生長不可缺少的過程，YUCCAs(YUCs)基因家族是依賴于色氨酸IAA合成途徑中的限速酶。擬南芥YUC基因家族不同成員的時空表達(dá)方式存在差異[1]，利用組合缺失突變體研究表明，YUCs不僅在幼苗生長、花發(fā)育及維管的形成等眾多發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用而且能增強植物的抗旱能力[2]。水稻基因組有14個成員(YUC1-14)[3-5]，研究發(fā)現(xiàn)，OsYUC1基因在水稻根系和植株發(fā)育過程中有重要調(diào)節(jié)作用。COW1基因編碼一個新的YUC蛋白成員，該基因調(diào)節(jié)根/冠比和葉發(fā)育并維持水分平衡，突變體cow1側(cè)根數(shù)目減少[6]。NAL7編碼OsYUC 8蛋白，過量表達(dá)NAL7cDNA導(dǎo)致生長素產(chǎn)生過量，引起根過度生長和形態(tài)異常[4]。這些研究結(jié)果表明，OsYOsUCs基因在調(diào)節(jié)水稻根系生長發(fā)育過程中起重要作用，但不同成員的作用存在差異。

環(huán)境信號與生長素信號通過交互作用控制植物的生長。如干旱、重金屬和鹽等逆境因子誘導(dǎo)活性氧(ROS)過量積累，引發(fā)擬南芥根系生長素的重新分布，進(jìn)而影響其形成和發(fā)育[7-10]。研究表明，ROS和重金屬等通過調(diào)節(jié)生長素信號途徑上關(guān)鍵基因家族如OsYUCs的表達(dá)而影響水稻根系的生長[11-14]。

OsYUC2基因是水稻生長素合成基因家族OsYUCs的重要成員之一。前期研究顯示，OsYUC2的表達(dá)有顯著的發(fā)育時期和組織器官特異性，即在細(xì)胞分裂旺盛的幼嫩組織和器官中表達(dá)高。過量表達(dá)OsYUC2增加了生長素的含量，促進(jìn)了水稻植株特別是根系的生長發(fā)育，但是該基因是否與水稻抗逆有關(guān)還不清楚。本實驗旨在分析干旱和H2O2脅迫對OsYUC2過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗生長生理的影響，為更好的了解OsYUC2基因與植物抗逆之間的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

挑選籽粒飽滿的野生型水稻(日本晴，WT)和PUbi-OsYUC2-GUS轉(zhuǎn)基因水稻(G 3株系)種子，去殼后消毒：75%乙醇(30 s)、0.1%氯化汞(15 min)、2%次氯酸鈉(20 min)，用無菌水沖洗干凈，再將種子植入MS培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱(光周期為14 h光照，光照強度為200μmol·(m2·s)-1，溫度26 ℃，夜間10 h，溫度22 ℃；相對濕度為50%～60%)內(nèi)培養(yǎng)8 d。然后轉(zhuǎn)到Hoagland營養(yǎng)液使其適應(yīng)24 h，再分別用10% PEG-6000、15% PEG-6000分別處理24 h，到終濃度20% PEG-6000處理72 h，或者分別用0.000 6% H2O2、0.006% H2O2各處理24 h，到終濃度0.06% H2O2處理72 h后進(jìn)行生理和生化指標(biāo)測定。每天更換1次培養(yǎng)液，每種處理重復(fù)3次，每次至少3個重復(fù)，每個重復(fù)約50株。

1.2 生長指標(biāo)統(tǒng)計

株高、初生根和不定根長度用尺子測量，側(cè)根數(shù)量和長度在解剖鏡下統(tǒng)計，每個處理至少用60株幼苗，數(shù)據(jù)用每株的平均值表示。

1.3 H2O2的定性和定位測定

利用DAB染色法對根尖H2O2進(jìn)行定性和定位分析[15]，每種處理每次重復(fù)至少用20株染色。

1.4 MDA含量測定

用硫代巴比妥酸(TBA)法[16]測定丙二醛(Malon dialdehyde MDA)含量。

1.5 相對含水量測定

相對含水量(%)=[(鮮重-干重)/(吸脹重-干重)]×100%。

1.6 根系GUS活性分析

野生型水稻(日本晴，WT)、DR5-GUS和PUbi-OsYUC2-GUS轉(zhuǎn)基因水稻(G 3株系)經(jīng)上述(1.1)同樣培養(yǎng)和處理，取根系進(jìn)行GUS染色[17]。每個處理至少重復(fù)3次，每次重復(fù)至少用20株進(jìn)行GUS染色。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實驗結(jié)果用3次獨立重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示。利用單因子方差分析各種處理與對照之間以及WT與G 3轉(zhuǎn)基因株系之間的差異，p<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 過量表達(dá)OsYUC2轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對干旱和H2O2脅迫的生長應(yīng)答

1)PEG和H2O2處理對過量表達(dá)OsYUC2轉(zhuǎn)化苗株高的影響。

非脅迫條件下G 3的株高顯著大于WT的(p<0.05)。與對照組比，PEG和H2O2處理都抑制了G 3和WT地上部分的生長(p<0.05)，但是G 3的株高仍然顯著大于WT的(p<0.05，圖1 A)。

2)PEG和H2O2脅迫對OsYUC2轉(zhuǎn)化苗初生根及其側(cè)根生長的影響。

由圖1 B可見，對照組和處理組G 3與WT的初生根長度差異不顯著(p>0.05，)。與對照組比，PEG處理顯著促進(jìn)了WT初生根上側(cè)根的形成(p<0.05)，但G 3的變化不明顯(圖2 A)；H2O2對G 3和WT初生根上的側(cè)根形成都有顯著的抑制作用(p<0.05)。圖2 B顯示，與對照組比，PEG和H2O2處理條件下G 3和WT初生根上側(cè)根的伸長生長都受到抑制，但G 3的側(cè)根長度仍然顯著大于WT的(p<0.05)。

注：小寫字母表示對照組與處理在p<0.05水平差異顯著；大寫字母表示相同條件下WT和G 3之間在p<0.05水平差異顯著。下同。圖1 PEG和H2O2處理對WT和G 3轉(zhuǎn)基因水稻幼苗株高和初生根長度的影響

圖2 PEG和H2O2處理對WT和G 3轉(zhuǎn)基因水稻幼苗初生根上側(cè)根數(shù)量和長度的影響

圖3 PEG和H2O2處理對WT和G 3轉(zhuǎn)基因水稻幼苗不定根數(shù)量和長度的影響

圖4 PEG和H2O2處理對WT和G 3轉(zhuǎn)基因水稻幼苗不定根側(cè)根數(shù)量和長度的影響

3)PEG和H2O2脅迫對OsYUC2轉(zhuǎn)化苗不定根及其側(cè)根生長的影響。

PEG處理后G 3和WT的不定根數(shù)量和長度與對照組的無顯著差異(p>0.05)；而H2O2明顯抑制二者不定根的形成和伸長生長(圖3)。

與對照組比，PEG處理顯著促進(jìn)了WT不定根上側(cè)根的形成(圖4 A，p<0.05)，但G 3的無顯著變化；H2O2則明顯抑制二者不定根上側(cè)根的形成，不過G 3的數(shù)量仍然顯著大于WT的(p<0.05)。盡管H2O2和PEG對G 3和WT不定根上側(cè)根的伸長生長都有抑制作用，但是G 3不定根上側(cè)根的長度顯著大于WT的(圖4 B，p<0.05)。

2.2 過量表達(dá)OsYUC2轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對干旱和H2O2脅迫的生理生化應(yīng)答

1)PEG和H2O2對OsYUC2轉(zhuǎn)基因水稻植株相對含水量和根系MDA含量的影響。

圖5 A顯示，PEG處理后WT和G 3的相對含水量都比對照組的下降，但是G 3的降低幅度小于WT的(p<0.05)；H2O2處理后WT和G 3的相對含水量也都降低，不過二者之間差異不顯著(p>0.05)。相反，PEG和H2O2處理組MDA含量都比對照組的增加(圖5 B)，但是G 3的增加量明顯小于WT的(p<0.05)。H2O2處理后，WT的MDA比對照增加42.6%，G 3的MDA比對照增加25.9%，WT與G 3之間差異顯著(p<0.05)。

2)PEG和H2O2對OsYUC2轉(zhuǎn)基因水稻根尖H2O2積累和分布的影響。

從H2O2積累量看，PEG和H2O2處理后WT和G 3轉(zhuǎn)基因株系初生根、不定根和側(cè)根根尖的H2O2積累量都比在生長素研究中，常用DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻的GUS活性和分布來分析生長素的積累和分布。本實驗中對照組與PEG對照組的增加，但是G 3的增加量小于WT的(圖6，以不定根根尖為例)。從H2O2空間分布看，PEG處理條件下，WT的H2O2從分生區(qū)到成熟區(qū)都有分布，G 3的主要集中在分生區(qū)和伸長區(qū)；H2O2處理后WT和G 3根尖的H2O2積累從分生區(qū)到成熟區(qū)都有分布，但是G 3成熟區(qū)的H2O2分布明顯少于WT的。

圖7 PEG和H2O2處理對WT和G 3轉(zhuǎn)基因水稻幼苗根系GUS活性和分布的影響

圖5 PEG和H2O2處理對WT和G 3轉(zhuǎn)基因水稻幼苗相對含水量和MDA含量的影響

注：箭頭指示分生區(qū)。圖6 PEG和H2O2處理對WT和G 3轉(zhuǎn)基因水稻幼苗不定根根尖H2O2積累和分布的影響

3)PEG和H2O2對OsYUC2轉(zhuǎn)基因水稻和DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻根系GUS活性和分布的影響。

對照組G 3的GUS活性高且在整個根系分布相對均勻。PEG處理后G 3轉(zhuǎn)基因水稻根系的GUS活性顯著降低且呈現(xiàn)梯度分布，染色部位主要集中在初生根、不定根和側(cè)根的根尖及新生側(cè)根(圖7)，而且根尖分生區(qū)和伸長區(qū)的GUS活性比對照組的顯著降低(圖8，以初生根根尖為例)，說明PEG影響OsYUC2基因的表達(dá)部位和空間分布。H2O2處理后G 3轉(zhuǎn)基因水稻根系的GUS活性也顯著降低，特別是初生根、不定根及成熟側(cè)根的分生區(qū)幾乎沒有GUS活性，染色部位主要集中在成熟區(qū)的維管組織和新生側(cè)根，說明H2O2也影響OsYUC2基因的表達(dá)部位和空間分布(圖7，圖8)?；騂2O2處理組G 3根系與DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻根系的GUS活性和分布樣式的變化類似，說明PEG和H2O2減少生長素的積累并影響其分布(圖7，圖8)。PEG和H2O2脅迫影響根系特別是側(cè)根的形成和生長與其減少生長素積累并改變生長素的空間分布有密切關(guān)系。OsYUC2過量表達(dá)使生長素含量增加，這在一定程度上緩解了由于PEG和H2O2脅迫導(dǎo)致生長素減少引起的傷害，故轉(zhuǎn)基因水稻植株受抑制的程度低于WT的。

注：箭頭指示分生區(qū)和維管組織。圖8 PEG和H2O2處理對WT、G 3轉(zhuǎn)基因水稻和DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻幼苗初生根根尖GUS活性和分布的影響

3 討 論

生長素合成基因家族YUCs在幼苗生長、根系生長發(fā)育和植物抗逆中有重要作用[2,4,6]。本實驗中，OsYUC2基因過量表達(dá)促進(jìn)了水稻幼苗和根系的生長。研究發(fā)現(xiàn)，激活擬南芥YUC7基因的表達(dá)能促進(jìn)側(cè)根生長并增強植物的抗旱能力[2]；在馬鈴薯中過量表達(dá)AtYUC6也提高了抗旱水平[18]；本實驗得到類似結(jié)果。在PEG和H2O2脅迫下OsYUC2過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻G 3的生長尤其是側(cè)根的生長好于WT的(圖1～圖4)，而MDA和H2O2的積累量比WT的少(圖5，圖6)。說明OsYUC2基因過量表達(dá)在一定程度上提高了植株對干旱和H2O2脅迫的抗性。

在環(huán)境脅迫應(yīng)答過程中細(xì)胞氧化狀態(tài)是決定植物生長的關(guān)鍵因子，細(xì)胞氧化信號從合成、結(jié)合、氧化、運輸?shù)叫盘杺鲗?dǎo)等多個水平調(diào)節(jié)生長素生物學(xué)[19]。脅迫因子誘導(dǎo)ROS積累，引起細(xì)胞氧化狀態(tài)的變化，影響生長素的時空分布和植物生長，而生長素的分布與生長素合成和運輸有關(guān)。重金屬和鹽等脅迫誘導(dǎo)擬南芥生長素的重新分布，進(jìn)而影響根系的形成和發(fā)育[7-10]。本實驗中，PEG和H2O2處理顯著降低了G 3根系GUS的活性，還改變了其空間分布。更重要的是對照組與處理組G 3與DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻根系的GUS活性和分布樣式的變化一致(圖7，圖8)，說明PEG和H2O2減少了生長素的積累并影響其梯度分布。PEG和H2O2脅迫影響根系生長與其減少生長素積累并改變生長素的空間分布有密切關(guān)系。本研究中，G 3植株受抑程度低于WT的，可能是OsYUC2基因過量表達(dá)使生長素含量增加，一定程度緩解了PEG和H2O2脅迫引起的傷害。

4 結(jié) 論

生長素合成與植物生長發(fā)育及抗逆有密切關(guān)系。過量表達(dá)OsYUC2基因不僅促進(jìn)了水稻幼苗的生長，而且還在一定程度上提高了轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對干旱和H2O2脅迫的抗性水平。