劉 芳 韓倩云 倪元穎*

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100

2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

多酚氧化酶（PPO）是蘋果褐變的關(guān)鍵酶[1]。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)PPO不僅導(dǎo)致果蔬的褐變，其在植物逆境脅迫防御[2]、次生代謝及細(xì)胞死亡方面都有著非常重要的作用[3]。有研究表明：PPO可分為可溶態(tài)和結(jié)合態(tài)，蘋果中可溶態(tài)只占8%～15%[4-5]。Guardo等[6]研究表明新鮮蘋果加工中褐變與PPO的表達(dá)相關(guān)，利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究蘋果褐變機(jī)理，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的基因型（Md-PPO）與褐變差異性相關(guān)。Mellidou等[7]通過基因技術(shù)研究蘋果采后貯藏中果肉褐變機(jī)理，發(fā)現(xiàn)兩種PPOs被誘導(dǎo)。綜上研究表明蘋果褐變問題與PPO存在形式密切相關(guān)。國內(nèi)外對(duì)游離態(tài)多酚氧化酶生理、生化特性方面的研究取得了較多成果，而對(duì)膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶（mPPO）在褐變中的作用以及其對(duì)果實(shí)傷害褐變的調(diào)控研究甚為缺乏。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是其功能的分子基礎(chǔ)，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對(duì)理解、揭示蛋白質(zhì)的功能具有重要指導(dǎo)意義[8]。在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，對(duì)膜蛋白知之甚少，解析膜蛋白結(jié)構(gòu)，研究膜蛋白功能是當(dāng)前生物學(xué)領(lǐng)域最前沿的研究熱點(diǎn)之一。目前已知跨膜蛋白三維結(jié)構(gòu)的只有少數(shù)幾種[9]。由于膜蛋白疏水結(jié)構(gòu)域的存在，蛋白在水相環(huán)境中容易聚合，使膜蛋白的純化和結(jié)晶較為困難，這是膜蛋白結(jié)構(gòu)解析的最主要瓶頸之一[10]。David[11]試圖從氨基酸序列和結(jié)構(gòu)來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能。Johannes Hermann等[12]在《Nature》雜志封面文章上提出，對(duì)于一種未知功能的酶，基于結(jié)構(gòu)來預(yù)測(cè)其活性的可能性。

mPPO活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于可溶態(tài)多酚氧化酶，其對(duì)果蔬生產(chǎn)及貯藏影響巨大，對(duì)mPPO分子特性及結(jié)構(gòu)的研究非常重要[13]。本文對(duì)富士蘋果中mPPO的生物學(xué)信息進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位等，為研究蘋果中mPPO的生物特性及結(jié)構(gòu)特性提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

以實(shí)驗(yàn)室前期分離純化的膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶一級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2 理論方法和步驟

1.2.1 富士mPPO氨基酸組成及特性分析 利用Geneva 大學(xué) Expasy 站點(diǎn)（http：//expasy.org/）中的ProtParam程序分析mPPO蛋白的氨基酸組成（http：//web.expasy.org/protparam/）。利用中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物信息中心軟件（http：//www.biosino.org/pages/protein2.htm）分析mPPO理化特性。

1.2.2 富士mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 采用Expasy 站點(diǎn)（http：//expasy.org/）的各種軟件及各種結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件，根據(jù)所得到的氨基酸序列對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。采用ExPASy中的GOR（Gamier-Osguthorpe-Robson）二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具（網(wǎng)址：https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）對(duì)mPPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 富士mPPO疏水性分析 疏水性分析軟件ExPASy 中 的 ProtScale 程 序（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）可用來計(jì)算蛋白質(zhì)的疏水性圖譜，本論文利用此程序?qū)Ω皇刻O果中mPPO進(jìn)行疏水性分析。

1.2.4 富士mPPO跨膜分析 根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列，借助Expasy中的TMPRED對(duì)mPPO蛋白的跨膜區(qū)、是否含有信號(hào)肽以及是否位于膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)等進(jìn)行預(yù)測(cè)（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.htm）。對(duì)于TMpred給出的結(jié)果，結(jié)合倫敦大學(xué)PSIpred程序（protein structure prediction server，網(wǎng) 址：http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）對(duì)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)綜合分析，以得到較為合理的結(jié)果。

1.2.5 富士mPPO亞細(xì)胞定位 利用分析預(yù)測(cè)軟件 targetp v1.1 server（網(wǎng)址：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/），預(yù)測(cè)富士蘋果中mPPO的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 富士mPPO氨基酸組成及特性分析

ProtParam程序?qū)Ω皇縨PPO氨基酸組成的分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 mPPO的氨基酸組成分析Fig.1 The amino acids composition of mPPO

如圖1所示，mPPO的氨基酸含量最多的為Thr（8.7%），其次為 Asp（7.8%）、Leu（7.8%）、Lys（7.5%）和Ala（6.7%）。不含 Pyl和Sec。對(duì) PPO 功能起重要作用的組氨酸（His）含量為2.5%。疏水性氨基酸通常存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部，避免與外界水溶液接觸；其中mPPO中疏水性氨基酸所占比例分別為：Met（蛋氨酸 1.5%）、Trp（色氨酸 1.3%）、Phe（苯丙氨酸 4.8%）、Val（纈氨酸 5.0%）、Leu（亮氨酸7.8%）、Ile（異亮氨酸 4.7%）、Pro（脯氨酸 7.2%）和Ala（丙氨酸6.7%）。親水性最強(qiáng)的兩種氨基酸分別是Arg（精氨酸4.2%）和Lys（賴氨酸7.5%）。從氨基酸組成可看出，mPPO中疏水性氨基酸占比例為40%以上。mPPO理化特性分析結(jié)果如表1所示。

表1 mPPO的理化特性Table 1 Physicochemical characteristics of mPPO

不穩(wěn)定性系數(shù)是表示蛋白穩(wěn)定性的參數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定性蛋白質(zhì)相比，在不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)中有一些二肽出現(xiàn)的頻率明顯不同。由此設(shè)計(jì)了400個(gè)不同二肽不穩(wěn)定性重量值，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析不穩(wěn)定性系數(shù)。當(dāng)一個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40時(shí)，則該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)是一個(gè)蛋白質(zhì)中脂肪側(cè)鏈所占的相對(duì)值，脂肪系數(shù)可作為球蛋白熱穩(wěn)定性增加的陽性因素。

從檢索結(jié)果看，mPPO的理論穩(wěn)定指數(shù)為41.72（不穩(wěn)定系數(shù)小于40為穩(wěn)定，大于40為不穩(wěn)定），表明這種蛋白為不穩(wěn)定蛋白。GRAVY值通常可以用來表征蛋白質(zhì)的疏水性，其范圍一般在2與-2之間。疏水蛋白的GRAVY值為正值，親水蛋白的GRAVY值則為負(fù)值[14]。mPPO的GRAVY值為-0.540，為負(fù)值，表明這種蛋白為親水蛋白。雖然此分值很有用，但是如果沒有hydropathy plot的協(xié)助是不能夠可靠地預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的。脂肪簇指數(shù)也可以表征蛋白質(zhì)的疏水性，脂肪簇指數(shù)越大，則表明疏水性越強(qiáng)。結(jié)果顯示mPPO的脂肪簇指數(shù)為70.03。根據(jù)hydropathy plot對(duì)mPPO疏水性質(zhì)的分析結(jié)果及圖3（mPPO的溶劑可接近性分析），綜合分析得出，蘋果中mPPO為表面疏水性蛋白。

富士蘋果mPPO的溶劑可接近性分析結(jié)果如圖2所示。溶劑可接近性是代表蛋白內(nèi)氨基酸暴露于構(gòu)象蛋白表面程度的一個(gè)指標(biāo)。從圖2可看出，暴露表面的殘基為45.74%，埋藏內(nèi)部的氨基酸殘基為47.08%。

2.2 富士mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

圖2 mPPO蛋白溶劑可接近性（利用PredictProtein seartificial預(yù)測(cè)）Fig.2 Solvent accessibility of mPPO by PredictProtein seartificial

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)可看作是多肽鏈的局部構(gòu)象，指蛋白質(zhì)多肽鏈的折疊和盤繞的方式，主要由近程作用力形成，常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和凸起等幾種形式，是構(gòu)成蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本元素，相鄰二級(jí)結(jié)構(gòu)之間通過一些無規(guī)則的卷曲連接成一個(gè)完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)[15]。對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)算法，目前最好的單序列預(yù)測(cè)程序能夠達(dá)到70%左右?；趇nformation theory的GOR IV準(zhǔn)確度可達(dá)到69.7%?；谏窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)的為76%～77%。但隱馬爾科夫模型（HMM）預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度不高[16]。本論文利用PredictProtein seartificial（基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，ArtificialNeural Networks，簡(jiǎn)寫為 ANNs）和GOR 算法分別對(duì)富士蘋果mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 利用PredictProtein seartificial預(yù)測(cè)的mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)（紅色為α螺旋，黃色為β折疊）Fig.3 The secondary structure map of mPPO by PredictProtein seartificial

圖4 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The secondary structure map of mPPO

GOR算法是單序列預(yù)測(cè)方法中的一種，這種方法以信息論為基礎(chǔ)，屬于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的一種，而且是所有統(tǒng)計(jì)算法中理論基礎(chǔ)最好的。GOR方法同時(shí)考慮被預(yù)測(cè)位置本身氨基酸殘基種類對(duì)該位置構(gòu)象的影響及相鄰殘基種類對(duì)該位置構(gòu)象的影響兩個(gè)方面，物理意義清楚明確，數(shù)學(xué)表達(dá)嚴(yán)格，預(yù)測(cè)的成功率提高到70%左右[17]。富士蘋果中mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)各構(gòu)象組成比例如表2所示。結(jié)果表明，mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋為18.67%，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量為23.33%，剩余的無規(guī)卷曲則為58.00%。預(yù)測(cè)的結(jié)果中，mPPO蛋白不含310螺旋、Pi螺旋、β-橋、β-轉(zhuǎn)角、彎曲結(jié)構(gòu)，以及其他結(jié)構(gòu)。

表2 mPPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Table 2 Secondary structural content prediction of mPPO by GOR

2.3 富士mPPO疏水性分析

富士蘋果中mPPO疏水性分析結(jié)果如圖5所示。

圖5中，橫坐標(biāo)為序列位置，縱坐標(biāo)為氨基酸的標(biāo)度值。Hphob.kyte&Doolittle標(biāo)度定義疏水性氨基酸較高的打分值（大于0值表示疏水性，小于0值表示親水性）。從圖上我們可看出，mPPO分值在0以上，為疏水性蛋白。

2.4 富士mPPO跨膜分析

根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列，借助Expasy中的TMPRED對(duì)mPPO蛋白的跨膜區(qū)、是否含有信號(hào)肽以及是否位于膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3、表4及圖6所示。

圖5 GFAP親疏水性分布圖Fig.5 GFAP affinity-disaffinity water distribution

表3 TMPRED預(yù)測(cè)的跨膜螺旋信息Table 3 Possible transmembrane redions and orientation

表4 跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型信息Table 4 Possibie models considered，only significant TM-segments used

TMpred對(duì)提交的蛋白序列給出了兩種可能的結(jié)果，一種是先從外面到內(nèi)，一種是先從內(nèi)到外。從表3及表4分析可知，最優(yōu)的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有兩個(gè)：8～33（從外到內(nèi)）和83～105（從內(nèi)到外）。對(duì)于TMpred給出的結(jié)果，結(jié)合倫敦大學(xué)PSIpred程序（protein structure prediction server）對(duì)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)綜合分析，以得到較為合理的結(jié)果。

從圖6可看出，PSIpred軟件預(yù)測(cè)mPPO中存在一段信號(hào)肽段，在肽段前面和后面各有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。具體的跨膜信息如圖7所示。

圖6 PSIpred軟件預(yù)測(cè)的mPPO跨膜結(jié)構(gòu)Fig.6 Schematic diagram of the MEMSAT3 and MEMSATSVM predictions for the query sequence

圖7 PSIpred軟件預(yù)測(cè)的mPPO跨膜肽段方向Fig.7 The cartoon of MEMSATSVM and MEMSAT3

從圖7可看出，mPPO是一個(gè)膜整合蛋白，大部分肽段位于細(xì)胞質(zhì)中，在肽段的1～39氨基酸殘基為信號(hào)肽，82～97為N-端的一段跨膜肽段（由外到內(nèi)），而548～567為C端的一段跨膜肽段（由內(nèi)到外）。這與TMpred的預(yù)測(cè)結(jié)果一致，但跨膜肽段的氨基酸具體位置有所差異。

2.5 富士mPPO亞細(xì)胞定位

富士蘋果中mPPO的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果如表5所示。cTP、mTP、SP分別表示葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（chloroplast transit peptide），線粒體目標(biāo)肽（mitochondrial targeting peptide）和信號(hào)肽（signal peptide）。Loc表示定位結(jié)果，分別為C、M和S。其中C表示葉綠體，M表示線粒體，如序列中包含線粒體靶向肽，S表示分泌路徑，如序列中包含分泌通路信號(hào)肽。定位于線粒體、葉綠體的蛋白質(zhì)是在游離核糖體上合成的，合成后由引導(dǎo)肽將蛋白質(zhì)導(dǎo)向靶位點(diǎn)。cTP或mTP值接近1，表明蛋白質(zhì)位于葉綠體或線粒體。RC值（Reliability class）表示預(yù)測(cè)的差異性，分為 5 級(jí)（1，2，3，4，5），數(shù)值越小表示預(yù)測(cè)結(jié)果越準(zhǔn)確。表5預(yù)測(cè)定位結(jié)果表明，富士蘋果中mPPO位于葉綠體。

表5 mPPO的亞細(xì)胞定位結(jié)果Table 5 The sub-cellular localization results of mPPO

對(duì)于植物體中PPO的定位，尚無一致意見（或認(rèn)為定位于類囊體PPO或者與類囊體膜相結(jié)合，或是溶解在膜腔中）。果蔬細(xì)胞組織中PPO存在的位置因果蔬的種屬、品種及成熟度的不同而不同，研究表明，有活性的PPO常分布于正常細(xì)胞的質(zhì)體中[18]。茶葉中的PPO分為游離態(tài)和束縛態(tài)，前者主要存在于細(xì)胞液中屬可溶態(tài)PPO，而后者則主要存在于葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中，與這些細(xì)胞器的膜系統(tǒng)或其他特異部位結(jié)合呈不溶態(tài)；新鮮蘋果中，多酚氧化酶幾乎全部存在于葉綠體和線粒體中。劉乾剛[19]認(rèn)為細(xì)胞壁也可能存在PPO。有些研究人員認(rèn)為多酚氧化酶可能僅存在于質(zhì)體中，缺乏質(zhì)體的組織就不存在多酚氧化酶，但是有質(zhì)體的組織也可能沒有多酚氧化酶。但也有人認(rèn)為含有質(zhì)體的植物組織不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有質(zhì)體的植物組織中[20]。就PPO組織定位來講，其廣泛存在于植物的各器官和組織，如花器官、分生組織、葉片、塊莖、根中，一般在幼嫩部分含量較多，而在成熟部分較少。Hunt等[21]報(bào)道，馬鈴薯葉片中只在幼嫩葉片中能檢測(cè)到，而且從頂芽到第11個(gè)葉芽中的PPO分布是恒定的。Dry等[22]報(bào)道，葡萄幼嫩的正在生長(zhǎng)的漿果、葉片、根中有高水平的PPO基因表達(dá)，而在成熟組織中卻較少。

3 結(jié)論

富士蘋果mPPO位于葉綠體膜上，為疏水性膜整合蛋白，其大部分肽段位于細(xì)胞質(zhì)中，肽段的1～39氨基酸殘基為信號(hào)肽，82～97為N-端的一段跨膜肽段（由外到內(nèi)），而548～567為C端的一段跨膜肽段（由內(nèi)到外）。mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋為18.67%，β-折疊為 23.33%，無規(guī)卷曲為58.00%，不含 310 螺旋、Pi螺旋、β-橋、β-轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)。通過信息學(xué)分析結(jié)果分析，我們推測(cè)富士蘋果mPPO與蘋果生物防御功能相關(guān)，可能在信號(hào)傳導(dǎo)過程起重要作用，與可溶態(tài)多酚氧化酶共同調(diào)控果蔬生理應(yīng)急防御及褐變，這將是mPPO未來研究的重要方向之一。