盧楊柳 馬靜一 艾志錄 ，， 謝新華 王 娜 黃忠民 索 標(biāo) ，，*

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 國家速凍米面制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心 鄭州450002

2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450002

3速凍面米及調(diào)制食品河南省工程實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450002）

由食源性致病菌引起的食品安全事件屢屢暴發(fā)，嚴(yán)重危害到人們的身體健康和食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。肉糜作為多種加工食品中的重要原材料，由于接觸表面積較大，容易被食源性致病菌污染。為了防止食源性致病菌造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，保障人們的食用安全，在食品中添加抑菌劑仍是目前食品工業(yè)界的重要手段之一[2]。肉桂醛是一種源于食品肉桂的植物源天然廣譜抑菌劑，近年來的研究表明，肉桂醛對沙門氏菌[3]等細(xì)菌和輪狀鐮刀霉菌[4]等真菌都有很強(qiáng)的抑制效果。肉桂醛等植物源天然產(chǎn)物作為食品級天然抑菌劑在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，有關(guān)肉桂醛對食源性致病菌的抑制效果及機(jī)理的研究已有報(bào)道，如Di Pasqua等[5]研究表明，肉桂醛使大腸桿菌和沙門氏菌的細(xì)胞膜長鏈不飽和脂肪酸發(fā)生變化。對單核細(xì)胞增生李斯特菌的研究表明，肉桂醛可抑制細(xì)胞能量的產(chǎn)生，阻礙葡萄糖的利用和攝取，并對細(xì)胞膜的通透性具有破壞作用[6]。

在當(dāng)前的肉制品加工業(yè)中，熱處理方式仍是常用的殺菌手段[7]，然而過度的熱處理常造成食品營養(yǎng)和品質(zhì)的破壞，同時(shí)也會產(chǎn)生一定的危害物[8]。近年來，隨著預(yù)測微生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的快速發(fā)展，采用建立微生物消長模型的方法，對食源性致病菌在加工條件下的失活規(guī)律進(jìn)行擬合，對于在保障食品營養(yǎng)品質(zhì)的同時(shí)，更加有效地殺除致病菌具有重要意義[9-11]。此外，在食品中添加一定量的天然抑菌活性成分，與熱處理相結(jié)合，提高殺菌效率，從而在保證食品品質(zhì)的前提下保障食品安全，減少能源的消耗，在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，有關(guān)添加肉桂醛后對肉類食品中金黃色葡萄球菌的熱殺菌作用規(guī)律及其機(jī)制的研究，國內(nèi)外尚未有報(bào)道。

本試驗(yàn)中以豬肉糜為材料，添加不同濃度的肉桂醛，進(jìn)行不同溫度的熱處理。隨后將試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，選擇最優(yōu)殺菌模型。通過掃描電鏡對肉桂醛處理前、后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，探討肉桂醛對金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 菌株與菌懸液的制備

金黃色葡萄球菌ATCC6538來源于美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，于-80℃甘油管保存。在無菌操作臺上，將儲存的金黃色葡萄球菌接種到含0.6%酵母浸粉的TSA平板上，37℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取典型菌落至無菌的含0.6%酵母浸粉的TSB培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床上培養(yǎng)至指數(shù)后期（約108～109CFU/mL）。將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，5 000×g離心10 min，棄去上清液，重復(fù)上述步驟，得到約109CFU/mL的菌液備用。

1.2 培養(yǎng)基、試劑與設(shè)備

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、酵母浸粉（YE）、Baird-Parker基礎(chǔ)培養(yǎng)基、亞碲酸鉀卵黃增菌液，北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（分析純），天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。使用時(shí)均按使用說明配制。肉桂醛（≥98%，化學(xué)純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。豬肉糜購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy公司；JJ-CJ-2F潔凈工作臺，吳江市凈化設(shè)備總廠；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器、XH-T漩渦混合器，金壇市醫(yī)療儀器廠；THA-100恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科技儀器有限公司；LHP-250智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司；TGL-16G高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；0.01～1 000 mL移液器，德國Eppendorf公司；S-3400N-Ⅱ掃描電子顯微鏡，日本日立公司；1stOpt 5.0軟件，七維高科有限公司。

1.3 添加肉桂醛的肉糜樣品的處理

肉糜購自當(dāng)?shù)爻胁⒈４嬖?18℃冰箱中，使用前，將肉糜置于4℃條件下過夜解凍后，稱取3 g的樣品放入無菌自封袋中，加入肉桂醛使其終濃度分別為0，0.1%，0.5%，1.0%，與0.1 mL的菌液混合均勻后將肉碾成1～2 mm的薄片狀，并盡可能地排除袋內(nèi)的空氣以防止產(chǎn)生氣泡，以此來保證熱傳遞均勻，隨后封口待用。

1.4 熱處理

將準(zhǔn)備好的樣品放置在預(yù)熱的恒溫水浴鍋中進(jìn)行熱處理，水浴鍋的設(shè)定溫度分別為60，65，70，75℃，經(jīng)預(yù)定的時(shí)間處理后，立即放入冰水中冷卻。

1.5 菌落計(jì)數(shù)

將處理后的樣品在潔凈無菌的環(huán)境條件下，加入3 mL的鹽水（0.85%），在均質(zhì)器中拍打2 min，使之與樣品混合均勻。用0.85%的鹽水連續(xù)稀釋后，取1 mL菌液涂布于加有亞碲酸鉀卵黃增菌液的Baird-Parker選擇性固體培養(yǎng)基上，在37℃條件下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.6 掃描電子顯微鏡觀察

取1 mL的對照組（未添加肉桂醛）和處理（加0.05%和0.1%肉桂醛處理24 h）的菌液離心（4 000 r/min），棄上清，用 PBS（pH 7.2～7.4）緩沖液清洗 3次，加入2.5%的戊二醛（用PBS緩沖液配制）固定4 h后，用PBS緩沖液清洗2次，再用無菌純水清洗2次，隨后分別用30%，50%，70%，80%，90%，100%的乙醇依次梯度脫水，加50 μL的無水乙醇混合均勻后，將懸浮液滴在鋁箔紙上，自然風(fēng)干，噴金后進(jìn)行掃描電鏡觀察[12-13]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析與曲線擬合

每組試驗(yàn)平行3組，取平均值，標(biāo)準(zhǔn)差由Microsoft Excel 2013中的STDEV計(jì)算得出，數(shù)據(jù)分析通過Origin 9.0軟件得出。初級模型曲線擬合用 Curve Expert 1.4 擬合（https：//www.curveexpert.net/），該軟件包含60種模型[14]，選擇出最適合的模型來擬合曲線。本試驗(yàn)擬合結(jié)果得出4個(gè)較為合適的模型，分別為：

線性模型：

二次擬合：

指數(shù)擬合

多項(xiàng)式擬合：

y——時(shí)間為x的菌落數(shù)的對數(shù)值（lg CFU/g）；x——時(shí)間（min）；a，b，c——模型參數(shù)。

以初級模型的參數(shù)為基礎(chǔ)建立二級模型，二級模型由1stOpt 5.0軟件擬合得出。

二級模型擬合公式為：

y——t7.0的自然對數(shù)；t7.0--殺死7 lg CFU/g所需要的時(shí)間；x1--肉桂醛含量（%）；x2——處理溫度（℃）；a，b，c——模型參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂醛添加的豬肉糜中金黃色葡萄球菌的熱失活模型擬合

2.1.1 初級模型 為了研究肉桂醛對熱處理豬肉糜中金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制效果，本試驗(yàn)采用了60，65，70，75℃等4個(gè)溫度梯度分別處理添加不同濃度肉桂醛的豬肉糜，并將16組試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的平均值用CurveExpert軟件進(jìn)行擬合，從而通過對比選擇出最優(yōu)模型。表1中列出的4個(gè)模型（分別是線性、二次擬合、指數(shù)擬合和多項(xiàng)式擬合模型）是在60種模型中選擇出的最為合適的4個(gè)模型，每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合相關(guān)系數(shù)都大于0.9。將這4種模型進(jìn)行比較可以得出，多項(xiàng)式擬合的相關(guān)系數(shù)更高，全部在0.98以上。故本試驗(yàn)選擇多項(xiàng)式擬合作為初級模型來描述肉桂醛對豬肉糜中金黃色葡萄球菌的熱失活促進(jìn)作用。

表1 線性模型、二次擬合、指數(shù)擬合和多項(xiàng)式擬合的標(biāo)準(zhǔn)誤差（s）和相關(guān)系數(shù)（r）統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical parameter，standard error（s）and relation index（r）from the individually linear，quadratic fit，exponential fit，and polynomial fitting models

將16組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合結(jié)果如圖1所示，隨著處理溫度的升高，擬合曲線從平滑到逐漸出現(xiàn)肩形，在70℃時(shí)，添加有1.0%肉桂醛試驗(yàn)組的擬合曲線隱約出現(xiàn)一個(gè)肩，當(dāng)溫度為75℃時(shí)，每組處理都有一個(gè)肩，隨著肉桂醛濃度的增加，肩出現(xiàn)的時(shí)間也逐漸縮短。模型擬合時(shí)出現(xiàn)肩和尾的形狀，在許多前人研究中均有報(bào)道[15]，Juneja等[16]擬合家禽肉中沙門氏菌的非線性生長曲線時(shí)，62.5℃和65℃條件下出現(xiàn)肩形擬合曲線。肩形的出現(xiàn)說明金黃色葡萄球菌對熱處理有一定的抵抗能力，肩形越來越窄，說明肉桂醛的添加降低了金黃色葡萄球菌的熱抵抗能力。

在不同溫度條件下，與不添加肉桂醛的樣品相比，肉桂醛對肉糜中金黃色葡萄球菌的抑制效果隨著溫度的升高而逐漸增加。當(dāng)熱處理溫度為60℃時(shí)，添加肉桂醛的樣品在0～5 min之間與不添加肉桂醛的對照樣品相比沒有明顯區(qū)別（P＞0.05）。隨后，隨著肉桂醛濃度的升高，抑菌效果逐漸增強(qiáng)，處理時(shí)間為20 min時(shí)，添加0.5%和1.0%肉桂醛的樣品比未添加肉桂醛樣品的菌落值低1 lg CFU/g左右。65℃時(shí)，在加熱初期添加肉桂醛的樣品和未添加肉桂醛的樣品沒有明顯區(qū)別（P＞0.05），2 min以后差距逐漸增大，添加0.5%和1.0%肉桂醛的樣品比未添加肉桂醛樣品的菌落值低1 lg CFU/g左右，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到10 min以后，差距逐漸減小，15 min時(shí)已無太大差距。當(dāng)豬肉糜樣品在70℃下處理2 min時(shí)，添加1.0%肉桂醛的樣品比不添加肉桂醛樣品的菌落值低約2 lg CFU/g。當(dāng)采用75℃的熱處理溫度時(shí)，添加1.0%肉桂醛的豬肉糜樣品在3 min后即無金黃色葡萄球菌檢出。由此得出，肉桂醛對豬肉糜中金黃色葡萄球菌的熱殺菌效果具有明顯的促進(jìn)作用，隨著熱處理溫度的升高，肉桂醛的促進(jìn)作用愈加明顯，而且隨著肉桂醛濃度的增大，金黃色葡萄球菌的失活速率更大。

圖1 多項(xiàng)式擬合肉桂醛對肉糜中金黃色葡萄球菌的熱失活規(guī)律Fig.1 Survival curves of S.aureus in ground pork for the different combinations of cinnamaldehyde concentrations for a temperature range from 60 to 70℃，as modeled by regression for polynomial fitting models

2.1.2 二級模型 將Ln t7.0與處理溫度和肉桂醛濃度以及初級模型的4個(gè)公式代入1stOpt軟件中，進(jìn)行二級模型擬合，并得出公式中的參數(shù)值以及擬合系數(shù)（R2）。將R2作為模型的選擇標(biāo)準(zhǔn)，R2越接近1說明模型擬合效果越好。將擬合結(jié)果進(jìn)行比較，選擇出較優(yōu)的一個(gè)模型作為二級模型。如表2所示，線性回歸模型擬合效果較好，擬合系數(shù)（R2）為 0.9310，說明初級模型參數(shù) Ln t7.0與處理溫度和肉桂醛濃度呈較好的線性關(guān)系。故線性模型更適合作為二級模型用來描述處理溫度和肉桂醛濃度對初級模型得到的參數(shù)Ln t7.0的影響。將初級模型得到的參數(shù)Ln t7.0與處理溫度、肉桂醛濃度以及公式（5）在1stOpt軟件中進(jìn)行擬合，得出公式（5）中參數(shù) a，b，c 的值，代入公式（5）可得出二級擬合模型的公式為：

Ln t7.0——t7.0的自然對數(shù)；t7.0——?dú)⑺? lg CFU/g所需要的時(shí)間；C——肉桂醛的含量（%）；T——溫度（℃）。其中10.02即為公式（5）中的a，-0.11 為公式（5）中的 b，-0.33 為公式（5）中的 c。

表2 二級模型擬合結(jié)果比較Table 2 Comparison of regressed secondary models

根據(jù)二級模型擬合結(jié)果，本研究得出Ln t7.0和肉桂醛的濃度及處理溫度的線性關(guān)系圖（圖2）。圖2a顯示出，隨著處理溫度的上升，Ln t7.0逐漸下降，75℃時(shí)，Ln t7.0的值達(dá)到最低。從圖2b中可以看出，不同溫度條件下，肉桂醛濃度對Ln t7.0值的影響隨著溫度的上升而逐漸增大，溫度為75℃時(shí)，肉桂醛的添加對Ln t7.0值的影響最為明顯，這與圖2a的結(jié)果一致。因此，該二級模型可根據(jù)豬肉糜中肉桂醛的添加濃度和處理溫度，估算出達(dá)到特定殺菌效果所需要的時(shí)間。

圖2 Ln t7.0和肉桂醛濃度及處理溫度的線性關(guān)系曲線Fig.2 The linear relationship curves between Ln t7.0and the cinnamaldehyde content and treatment temperature

2.2 不同濃度肉桂醛處理后金黃色葡萄球菌形態(tài)變化的掃描電鏡分析

肉桂醛處理前后金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)變化如圖3所示，未經(jīng)過肉桂醛處理的金黃色葡萄球菌（圖3a）菌體飽滿，呈較規(guī)則的球狀；經(jīng)過0.05%肉桂醛處理后（圖3b）的菌體個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)破洞，細(xì)胞內(nèi)液體外漏，細(xì)胞形狀大小不一；經(jīng)過0.1%肉桂醛處理（圖3c）的菌體大部分都出現(xiàn)漏洞，甚至菌體破碎，細(xì)胞嚴(yán)重破損，這也與前人的研究結(jié)果相一致[17]。已知溫和熱處理?xiàng)l件下，細(xì)胞膜的破損是食源性致病菌失活的主要原因[18]。因此，本研究得出肉桂醛加快金黃色葡萄球菌熱失活的可能原因是，在熱處理?xiàng)l件下肉桂醛促進(jìn)了金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的熱損傷，加快細(xì)胞質(zhì)泄露，從而加速細(xì)胞失活。

3 結(jié)論

本文將植物源天然抑菌劑與傳統(tǒng)的熱殺菌方法相結(jié)合，研究了豬肉糜中金黃色球菌的熱失活規(guī)律。本研究結(jié)果表明，在75℃時(shí)，添加1.0%肉桂醛對金黃色葡萄球菌的熱抵抗能力影響較大，顯著減少了熱殺菌所需的時(shí)間。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了模型擬合，得出多項(xiàng)式擬合適合作為初級模型，而線性曲線較適合建立二級模型，以描述肉桂醛添加后肉糜中金黃色葡萄球菌熱失活曲線。掃描電鏡觀察肉桂醛對金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的結(jié)果顯示，肉桂醛可以使金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜遭到嚴(yán)重的破損，這可能是其促進(jìn)金黃色葡萄球菌熱失活的重要原因。本研究結(jié)果所建立的二級模型可根據(jù)豬肉糜中肉桂醛的添加濃度和處理溫度，估算出達(dá)到特定殺菌效果所需要的時(shí)間，為以后肉桂醛在食品行業(yè)的應(yīng)用，尤其是在熱加工肉制品中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

圖3 掃描電鏡觀察肉桂醛處理下金黃色葡萄球菌的菌體形態(tài)Fig.3 Scanning electron micrographs of S.aureus following treatments with and without cinnamaldehyde