陳曉超 王 友 崔文明 李偉松 劉樹滔* 饒平凡

（1福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州 350108

2浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于自然界一切生物體內(nèi)，它能夠催化超氧陰離子自由基（O2-）發(fā)生歧化反應(yīng)，減輕或消除超氧陰離子自由基對(duì)生物體的氧化或過氧化損傷[1]。大量的前期研究表明，生物體的衰老、病變及輻射損傷等都與自由基在體內(nèi)的形成密切相關(guān)，而SOD作為自由基清除劑具有抗衰老、抗炎癥、抗輻射、抗自身免疫疾病和抑制腫瘤等生理功能[2-4]。人體中的超氧化物歧化酶有 3 種：Cu，Zn-SOD、Mn-SOD和EC-SOD。其中Cu，Zn-SOD在人體肝臟和大腦中含量最高，它以二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[5]。作為人體關(guān)鍵的抗氧化酶類之一，SOD被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食療和護(hù)膚美容等領(lǐng)域[6-8]。

迄今為止，國(guó)內(nèi)各研究單位已成功利用不同原核生物系統(tǒng)大量表達(dá)重組人源SOD蛋白，例如在大腸桿菌和畢赤酵母發(fā)酵體系中成功構(gòu)建與表達(dá)人源Cu，Zn-SOD[9-12]，并應(yīng)用于相關(guān)的抗放化療輻射[13-14]、抗紫外線輻射[15-16]、抗腦缺血再灌注損傷[17]、皮膚創(chuàng)傷修復(fù)[18]等研究。然而，將基因重組技術(shù)制備的Cu，Zn-SOD應(yīng)用于各種疾病的治療，首先必須解決的問題是如何去除工程菌在發(fā)酵表達(dá)重組蛋白質(zhì)過程中所造成的大量?jī)?nèi)毒素污染。如果未能解決這一關(guān)鍵純化問題，后續(xù)的一系列臨床前功能評(píng)價(jià)試驗(yàn)與潛在的臨床應(yīng)用都無(wú)法開展。

細(xì)菌內(nèi)毒素是一種脂多糖，主要來(lái)源于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁，當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后便會(huì)釋放出內(nèi)毒素[19-20]。內(nèi)毒素是一種毒性極強(qiáng)的致炎和熱原物質(zhì)，極微量?jī)?nèi)毒素進(jìn)入人體內(nèi)，就會(huì)引起高熱、腹瀉、血管擴(kuò)張，甚至休克或死亡[21]。對(duì)于非胃、腸道給藥制劑中去除內(nèi)毒素，始終是一項(xiàng)極其重要的任務(wù)[22]。目前常用的去除內(nèi)毒素的方法有膜過濾/超濾、活性炭吸附、柱層析/離子交換色譜或親和色譜法等多種[21，23-24]。本文采用活性炭吸附和Triton X-114萃取兩種方法去除重組蛋白溶液中內(nèi)毒素，通過對(duì)比二者在內(nèi)毒素去除效率和重組蛋白回收率兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，確定適合于大批量處理重組Cu，Zn-SOD蛋白溶液中內(nèi)毒素的最適工藝路線。本研究的目的在于有效清除重組蛋白溶液中的內(nèi)毒素，并保證目標(biāo)蛋白在純化過程中高回收率，使純化后蛋白溶液的內(nèi)毒素含量能夠達(dá)到藥典中要求的注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，完全可以應(yīng)用于保健食品的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：重組人源Cu，Zn-SOD來(lái)自畢赤酵母的大量表達(dá)；分析純級(jí)別活性炭和TirtonX-114等化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鱟試劑（靈敏度0.5 EU/mL），福州新北生化工業(yè)有限公司；內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（10EU/支），福州新北生化工業(yè)有限公司；無(wú)菌注射用水，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司；SOD酶活試劑盒，購(gòu)自南京建成生物研究所。

儀器：UV-1900紫外分光光度計(jì)、CR15-RX型高速離心機(jī)，日本日立公司生產(chǎn)；Colour Squid電動(dòng)磁力攪拌器、組織勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司生產(chǎn)；BS124-S型電子稱、PB-10型pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司生產(chǎn)；1285classic II超凈臺(tái)、超低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；HH-4型恒溫水浴箱，常州國(guó)華電器公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 活性炭吸附法去除內(nèi)毒素 向重組人源Cu，Zn-SOD蛋白溶液中添加1～10%（W/V）活性炭，4℃低溫?cái)嚢?，定時(shí)取樣待測(cè)SOD酶活力和內(nèi)毒素含量。樣品檢測(cè)前先使用0.22微米孔徑濾膜濾除活性炭顆粒，之后使用SOD試劑盒檢測(cè)蛋白溶液中SOD酶活力，使用鱟試劑盒檢測(cè)蛋白溶液中內(nèi)毒素含量。

1.2.2 Triton X-114萃取法去除內(nèi)毒素 向SOD蛋白溶液中添加1%Triton X-114，4℃低溫?cái)嚢柚恋鞍兹芤撼吻逋该?，轉(zhuǎn)移蛋白溶液至37℃恒溫水浴下保溫15 min后，12 000 r/min高速離心10 min，取上層清液用于檢測(cè)SOD酶活力及內(nèi)毒素含量。

1.2.3 內(nèi)毒素含量測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》第3部（2005版）進(jìn)行[25]。在鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)與供試品干擾試驗(yàn)達(dá)標(biāo)的情況下，使用靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，按照內(nèi)毒素凝膠半定量法檢測(cè)樣品。

1.2.4 SOD酶活力測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化方法測(cè)定SOD酶活力，具體操作按照南京建成生物工程研究所SOD試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)毒素限值的確定

參考藥典[25]，供試品的內(nèi)毒素限值L=K/M，單位用EU/U表示；其中，K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受內(nèi)毒素劑量，用 EU/（kg·h）表示；其中注射劑的 K=5 EU/（kg·h）；M 為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量。按照參考文獻(xiàn)[26]中，Cu，Zn-SOD純蛋白的人體最大給藥量約為32 mg/d，按酶比活換算為18 112 U酶活/天，一天給藥3次。那么標(biāo)準(zhǔn)體重的人體按60 kg計(jì)，注射所用時(shí)間按1 h計(jì)，則標(biāo)準(zhǔn)人體每公斤每小時(shí)的Cu，Zn-SOD純蛋白的最大給藥量不得超過1 006 U/（kg·h）。由此可以通過L=K/M 公式得出 Cu，Zn-SOD蛋白溶液產(chǎn)品中內(nèi)毒素限值為5.0×10-3EU/U，即每10 000酶活單位 Cu，Zn-SOD中內(nèi)毒素含量應(yīng)不超過50 EU效價(jià)。

2.2 活性炭吸附法

2.2.1 吸附時(shí)間對(duì)活性炭吸附效果的影響 首先考察活性炭吸附時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)內(nèi)毒素吸附效果的影響。向pH 6.0的Cu，Zn-SOD蛋白溶液中添加1.0% 的活性炭，低溫4℃攪拌，定時(shí)取樣檢測(cè)內(nèi)毒素含量，結(jié)果如圖1所示。隨著吸附時(shí)間的增加，蛋白溶液中內(nèi)毒素的含量逐漸減少。當(dāng)吸附時(shí)間為2 h，內(nèi)毒素含量從4.0×104EU/mL降至3.5×104EU/mL，降低了12.5%。隨著吸附時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，內(nèi)毒素吸附效果變化不明顯，推斷該濃度下活性炭對(duì)內(nèi)毒素的吸附能力在2 h左右趨于飽和。根據(jù)以上結(jié)果，后續(xù)活性炭吸附效果的評(píng)估試驗(yàn)均以吸附2 h進(jìn)行對(duì)比。

圖1 活性炭吸附內(nèi)毒素經(jīng)時(shí)變化曲線Fig.1 Time dependent manner of endotoxin removal with active carbon adsorption

2.2.2 不同pH對(duì)活性炭吸附效果的影響 其次，在確定吸附時(shí)間為2 h后，通過調(diào)整Cu，Zn-SOD蛋白溶液pH值，來(lái)考察pH值對(duì)活性炭吸附內(nèi)毒素效果的影響。由于本研究所表達(dá)的Cu，Zn-SOD的等電點(diǎn)在5.8左右，因此對(duì)pH值的優(yōu)化篩選的考察范圍設(shè)置在pH值5.0～7.0之間。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，蛋白溶液pH為7.0，6.5和6.0的條件下，活性炭對(duì)內(nèi)毒素的吸附效率很低，僅為2.5%，10%和12.5%。在蛋白溶液pH為5.5的條件下，活性炭對(duì)內(nèi)毒素的吸附效率有所提升，為22.5%。進(jìn)一步降低蛋白溶液pH值至5.0，活性炭吸附內(nèi)毒素的效果最佳，一次操作內(nèi)毒素的去除率可以達(dá)到50.0%左右。由此可見，在弱酸性pH環(huán)境下，有利于提高活性炭吸附內(nèi)毒素的效率。因此，在后續(xù)的蛋白純化回收工藝設(shè)計(jì)中，以pH 5.0作為活性炭吸附過程的最適pH值，以達(dá)到內(nèi)毒素吸附效果的最優(yōu)化。

2.2.3 活性炭添加量對(duì)吸附效果的影響在上述試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)而考察活性炭添加量對(duì)內(nèi)毒素去除效率的影響，后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)調(diào)整蛋白溶液pH值為5.0。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，當(dāng)活性炭的添加量在1%時(shí)，蛋白溶液內(nèi)毒素含量從未處理前的4.0×104EU/mL 降低至 1.95×104EU/mL，去除率達(dá)到51.2%。繼續(xù)增加活性炭的添加量達(dá)到3%時(shí)，蛋白溶液內(nèi)毒素含量從未處理前的4.0×104EU/mL降低至1.8×104EU/mL，去除率達(dá)到55%。當(dāng)活性炭的添加量上升為5%時(shí)，蛋白溶液內(nèi)毒素含量從未處理前的 4.0×104EU/mL降低至 1.19×104EU/mL，去除率達(dá)到70.8%。如果繼續(xù)增加活性炭使用量至10%時(shí)，蛋白溶液內(nèi)毒素含量從未處理前的 4.0×104EU/mL 降低至 2.69×104EU/mL，去除率大幅度降低，僅為32.8%；其原因歸結(jié)于10%的活性炭添加量導(dǎo)致蛋白溶液的黏度明顯上升，攪拌效率顯著降低，從而對(duì)活性炭吸附帶來(lái)了負(fù)面影響。因此，在后續(xù)的蛋白純化回收工藝設(shè)計(jì)中，選擇5%的活性炭作為最適活性炭添加量，以達(dá)到內(nèi)毒素去除效果的最優(yōu)化。

圖2 不同pH對(duì)活性炭吸附內(nèi)毒素的影響Fig.2 Effects of pH values of protein solution on endotoxin absorption by active carbon

2.3 TritonX-114萃取法

圖3 不同活性炭添加量對(duì)內(nèi)毒素吸附效果的影響Fig.3 Effects of concentrations of active carbon used on endotoxin adsorption

本試驗(yàn)考察Triton X-114萃取方法去除Cu，Zn-SOD蛋白溶液中內(nèi)毒素的效率。向蛋白溶液直接添加1%（V/V）的Triton X-114，置于低溫下，進(jìn)行重復(fù)3次的萃取后，蛋白溶液中的內(nèi)毒素含量明顯降低，從未處理前的4.0×104EU/mL陡降至500 EU/mL，結(jié)果見圖4。由于Triton X-114萃取過程中，對(duì)目標(biāo)蛋白溶液產(chǎn)生一定程度的濃縮效應(yīng)，因此蛋白溶液的SOD酶活有所上升，從35 564 U/mL增加到37 698 U/mL，蛋白溶液操作體積由未處理前的70 mL減少至64 mL，而該萃取過程的SOD酶活回收率高達(dá)96.9%?；谝陨辖Y(jié)果，可見Triton X-114萃取法去除內(nèi)毒素的效率明顯高于活性炭吸附法，而且在目標(biāo)蛋白的回收率上也有著非常明顯的優(yōu)勢(shì)；然而，從大批量去除內(nèi)毒素的工藝操作成本角度出發(fā)，活性炭吸附法的優(yōu)勢(shì)在于低成本，原材料可重復(fù)使用。因此本研究旨在設(shè)計(jì)適用于大批量蛋白溶液純化回收的工藝，綜合考慮操作成本和純化效率兩個(gè)角度，后續(xù)工藝優(yōu)化過程將結(jié)合采用活性炭吸附法和Triton X-114萃取法兩種方式。

2.4 三步法去除內(nèi)毒素工藝過程的優(yōu)化

通過活性炭吸附和Triton X-114萃取相結(jié)合方式去除內(nèi)毒素，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。經(jīng)過第一輪5%活性炭吸附，內(nèi)毒素含量從未處理前的4.0×104EU/mL降低至約10 000 EU/mL，內(nèi)毒素吸附率達(dá)75%；SOD酶活力從未處理前的37 500 U/mL降低至31 500 U/mL，該步驟的目標(biāo)蛋白回收率為81.4%。經(jīng)過第二步的Triton X-114反復(fù)萃取，蛋白溶液中內(nèi)毒素進(jìn)一步降低至200 EU/mL，僅為未處理前蛋白溶液中內(nèi)毒素含量的0.5%，目標(biāo)蛋白SOD的回收率仍維持在79.6%左右。經(jīng)過以上兩步純化步驟后，蛋白溶液中內(nèi)毒素含量為每10 000酶活單位內(nèi)毒素含量為57 EU效價(jià)，仍然略高于藥典中對(duì)注射藥品內(nèi)毒素限值50 EU/10 000 U酶活的要求。因此隨后繼續(xù)增加一步活性炭吸附操作，蛋白溶液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量降低為80 EU/mL，目標(biāo)蛋白SOD的回收率為66%，可以換算成蛋白溶液中內(nèi)毒素含量為每10 000酶活單位內(nèi)毒素含量為26.8 EU效價(jià)。

圖4 Triton X-114萃取前后與活性炭吸附前后內(nèi)毒素的含量變化的對(duì)比Fig.4 Comparison of removal efficiency of endotoxin with Triton X-114 phase separation or active carbon adsorption

表1 三步法去除內(nèi)毒素純化與回收效率表Table 1 Results of removal rates of endotoxin and recovery rates of Cu，Zn-SOD protein

2.5 殘留Triton X-114的去除

考慮到Triton X-114相分離法去除細(xì)菌內(nèi)毒素后，蛋白溶液中仍有部分Triton X-114殘留，對(duì)后期重組SOD蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的安全性和功效性評(píng)價(jià)結(jié)果存在著影響。因此，后續(xù)試驗(yàn)采用高效液相色譜法檢測(cè)蛋白溶液中Triton X-114的含量，明確三步法純化去除內(nèi)毒素過程中Triton X-114的殘留量。首先將質(zhì)量濃度分別為50，25，10，5，2.5，1.25 μg/mL 的 6 個(gè) Triton X-114 標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)過反相高效液相色譜柱TSKgel ODS-100V分析。圖5表明：在保留時(shí)間5 min至7.5 min之間，Triton X-114出現(xiàn)特征峰，峰值大小隨著濃度的降低而減小。讀取特征峰峰面積數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=3 208.7x+1 778.5（R2=0.9981）。取三步法去除內(nèi)毒素處理后的SOD蛋白溶液終產(chǎn)品，經(jīng)過反相高效液相色譜法分析可知Triton X-114僅為5.7 μg/mL。同時(shí)經(jīng)過離體細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)考察急性細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示細(xì)胞存活率為100%，確認(rèn)經(jīng)過三步法去除內(nèi)毒素處理后的SOD蛋白溶液終產(chǎn)品對(duì)細(xì)胞未顯示任何毒性。

3 討論

圖5 不同濃度Triton X-114的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of Triton X-114 with different concentrations

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的生物活性蛋白通過微生物進(jìn)行表達(dá)和大量制備。這些重組蛋白最終將被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)注射藥物和口服營(yíng)養(yǎng)保健品，相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中最關(guān)鍵的一項(xiàng)指標(biāo)就是內(nèi)毒素含量不可檢出或處于低檢測(cè)值。然而，以微生物作為蛋白質(zhì)表達(dá)載體的工藝以及在非真空條件下的生產(chǎn)環(huán)境，往往不可避免的會(huì)有細(xì)菌內(nèi)毒素污染。常見的微生物表達(dá)體系如大腸桿菌和畢赤酵母，重組蛋白在大腸桿菌的胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，在破碎細(xì)菌獲得重組蛋白的同時(shí)，細(xì)胞壁內(nèi)的內(nèi)毒素也隨之大量釋放到蛋白質(zhì)溶液中[27]；在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，重組蛋白被畢赤酵母主動(dòng)分泌到胞外，不存在細(xì)菌破壁導(dǎo)致大量?jī)?nèi)毒素污染問題，但是有研究表明某些真菌多糖也會(huì)對(duì)鱟法檢測(cè)和兔試法具有類似的生理效應(yīng)[28]；另外生產(chǎn)環(huán)境以及分離純化操作過程等因素也會(huì)造成蛋白質(zhì)溶液內(nèi)毒素的污染[21]。因此如何有效去除重組蛋白溶液中的內(nèi)毒素是所有重組蛋白相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中必須重點(diǎn)關(guān)注的環(huán)節(jié)。

去除蛋白溶液中內(nèi)毒素始終是一個(gè)非常棘手的技術(shù)問題[19]。由于各種基因重組蛋白的性質(zhì)各有不同，找到一種適用于所有重組蛋白溶液的通用方法是不可能的。常見的內(nèi)毒素去除方法有超濾、活性炭吸附、兩相萃取法、色譜分離法等方法，然而每種方法都有其相應(yīng)的缺陷。例如純化效果最好當(dāng)屬親和色譜法，但因該方法使用柱填料十分昂貴，不適用于大批量樣品的處理[29]。Triton X-114萃取法能非常高效的去除重組蛋白溶液中的內(nèi)毒素，但是Triton X-114作為一種非離子表面活性劑對(duì)細(xì)胞有著一定的損害，因此無(wú)法大量使用[30]。活性炭吸附法的優(yōu)點(diǎn)在于大批量操作成本低，且活性炭可反復(fù)使用。因此在實(shí)際蛋白質(zhì)純化過程中，往往需要以上各種分離方法相互配合、取長(zhǎng)補(bǔ)短。

國(guó)家藥典2015版[25]規(guī)定，人體用注射針劑的每公斤體重每小時(shí)的最大可接受細(xì)菌內(nèi)毒素劑量為 5 EU/（kg·h）。Richard和Frank 研究結(jié)果顯示，牛Cu，Zn-SOD的人體耐受量為32 mg/d，大約181 120 U/d[26]。通過換算，人用SOD注射針劑里，10 000 U酶活中所含有的細(xì)菌內(nèi)毒素不應(yīng)該超過50 EU。本試驗(yàn)中使用的重組人源Cu，Zn-SOD是一種水溶性非常好的蛋白質(zhì)，非常適合活性炭吸附法和Triton X-114相分離法。使用活性炭吸附法，pH為5.0的蛋白溶液中添加5%（W/V）的活性炭，4℃低溫吸附2 h，活性炭吸附能力達(dá)到飽和，內(nèi)毒素去除率達(dá)到75%，SOD酶活力回收率為81.4%。隨后使用TritonX-114萃取法，添加1%（V/V）的 Triton X-114，反復(fù)處理 3次，內(nèi)毒素去除率可達(dá)99.5%，酶活回收率為79.6%。通過三步法工藝去除內(nèi)毒素，蛋白溶液終產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量降低至28.6 EU/10 000 U酶活，低于 《中國(guó)藥典》（2005版）對(duì)注射藥品內(nèi)毒素限值50 EU/10 000 U酶活的質(zhì)量要求。由此可以明確，三步法純化重組SOD蛋白溶液的終產(chǎn)品完全符合藥典規(guī)定的注射用蛋白質(zhì)針劑內(nèi)毒素限量的質(zhì)量要求。

自從1990年Aida首次采用Triton X-114萃取法去除重組蛋白溶液中內(nèi)毒素，該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種重組蛋白質(zhì)溶液的內(nèi)毒素去除工藝[31]，其純化效果取得了普遍的認(rèn)可[27，30]。然而很少有研究者對(duì)溶液中Trition X-114的殘余及去除問題進(jìn)行探討。Triton X-114是一種聚乙二醇單辛基酚醚表面活性劑，能夠通過液相分離的方法萃取去除水相溶液中的細(xì)菌內(nèi)毒素。但是它作為一種非離子表面活性劑對(duì)細(xì)胞有著一定程度的損害，如果蛋白溶液中尚有Triton X-114殘留，必然會(huì)影響重組目標(biāo)蛋白在臨床前的安全性和功效性的評(píng)估。因此本研究中，最后一道工藝選擇使用活性炭吸附法，在進(jìn)一步去除細(xì)菌內(nèi)毒素的同時(shí)，也將吸附去除殘余的Triton X-114，確保重組蛋白質(zhì)樣品的安全可靠。《中國(guó)藥典》（2005）版[25]中對(duì)Triton X-100的殘留量要求為：半成品中不得大于 15 μg/mL，人用劑量可控制在7.5 μg/mL 以內(nèi)。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定三步法純化去除內(nèi)毒素過程終產(chǎn)品中的Triton X-114殘余量，結(jié)果顯示Triton X-114殘余量為5.7 μg/mL，低于《中國(guó)藥典》中對(duì)Triton殘留量的質(zhì)量要求；同時(shí)經(jīng)過離體細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)考察急性細(xì)胞毒性，SOD蛋白溶液終產(chǎn)品對(duì)細(xì)胞未顯示任何毒性作用。由此可以明確，三步法純化重組SOD蛋白溶液的終產(chǎn)品完全符合藥典規(guī)定的注射用蛋白質(zhì)針劑Triton殘余量的質(zhì)量要求。

綜上所述，本研究采用的活性炭吸附與Triton X-114相分離法相結(jié)合，去除重組酵母表達(dá)人Cu，Zn-SOD蛋白溶液中內(nèi)毒素，該純化工藝操作簡(jiǎn)易、周期短、適合大批量生產(chǎn)，操作成本低，重組蛋白回收率較高，終產(chǎn)品完全符合藥典規(guī)定的注射用蛋白質(zhì)針劑中內(nèi)毒素限量和Triton殘余量的質(zhì)量要求，完全可以應(yīng)用于潛在的保健食品開發(fā)。本研究的工藝設(shè)計(jì)和分離純化結(jié)果，可為其它重組蛋白去除內(nèi)毒素的工藝設(shè)計(jì)提供參考。