王 坤 曲亮璠 王祥河 劉 然 許勤虎

1（天津市工業(yè)微生物研究所有限公司，天津 300462）2（天津量信檢驗(yàn)認(rèn)證技術(shù)有限公司，天津 300462）3（天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司，天津 300462）

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）是我國(guó)名貴的中藥材，其宿主蝙蝠蛾幼蟲對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求極為嚴(yán)苛，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；曫B(yǎng)。野生冬蟲夏草資源緊缺，價(jià)格昂貴，尋求野生蟲草的替代品逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種藥食兩用真菌，與冬蟲夏草具有相似的化學(xué)成分和生物活性。研究表明，蛹蟲草內(nèi)核苷、多糖、甘露醇及甾醇類物質(zhì)具有抗疲勞、抗衰老、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降三高以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等藥理作用。對(duì)蛹蟲草進(jìn)行合理的開發(fā)利用，能夠滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的保健需求，具有良好的商業(yè)價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)空間。目前，我國(guó)蛹蟲草的人工種植技術(shù)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，由于該菌種極易受其他微生物污染，使產(chǎn)品品質(zhì)降低，影響經(jīng)濟(jì)效益。蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵的方法具有速度快、周期短、產(chǎn)量高、控制條件容易等特點(diǎn)，可以突破氣候、環(huán)境等因素的限制，避免不利因素對(duì)菌種發(fā)酵造成的負(fù)面影響，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在真菌發(fā)酵過程中，獲得大量的生物體是各種功效成分高效積累的基礎(chǔ)。目前，維生素B 族對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵的影響鮮有報(bào)道，本研究通過正交工藝優(yōu)化在一定程度上提高了該菌種菌絲體的產(chǎn)量，旨在為蛹蟲草資源的科學(xué)研究和開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：蛹蟲草（Cordyceps militaris），菌種編號(hào)：CICC 14013。

蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AE200 分析天平，Seven Multi pH 計(jì)，梅特勒-托利多集團(tuán)；GZX-9146 MBE 數(shù)字鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；MLS-3750 高壓滅菌鍋，三洋電氣公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草液體發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.1.1 液體菌種的制備

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L。

液體菌種培養(yǎng)基：蔗糖40.0g/L，蛋白胨20.0g/L，硫酸鎂1.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L。

取1 cm2大小斜面菌種接入500 mL 的錐形瓶中，裝液量為200 mL/瓶，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度22 ℃，培養(yǎng)5 d。

1.3.1.2 發(fā)酵單因素試驗(yàn)

選取不同磷酸二氫鉀、硫酸鎂添加量（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L）；不同維生素B1、B2、B6、B12添加量（10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L），蔗糖40.0 g/L，蛋白胨30.0 g/L，接種量7.5%，搖瓶裝液量100/250 mL，pH 6.5，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，22 ℃培養(yǎng)6 d。以蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體生物量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.1.3 正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，以獲得蛹蟲草液體發(fā)酵的最佳條件和最大菌絲體產(chǎn)量。

1.3.2 菌絲體生物量測(cè)定方法

菌絲體的生物量采用細(xì)胞干重法測(cè)定，將發(fā)酵產(chǎn)物置于布氏漏斗進(jìn)行抽濾，棄去濾液，用蒸餾水將菌絲體洗凈后，重復(fù)上述試驗(yàn)操作，將得到的菌絲體置于60 ℃烘干至恒重。生物量按下式計(jì)算：

式中：X——生物量，g/L；

W——細(xì)胞干重，g；

V——取樣體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 磷酸二氫鉀添加量對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響

磷酸二氫鉀添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響如圖1 所示。無機(jī)鹽是微生物菌體組成的一部分，也是一些酶的激活劑或者抑制劑，除此之外，還能夠調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基中的pH 值、氧化還原電位和滲透壓。鉀元素雖然不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，但能改變微生物細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的通透性，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓；磷元素是微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)合成的必要成分。隨著磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度的增加，蛹蟲草菌絲體干重呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度達(dá)到1.5 g/L 時(shí)，搖瓶液體發(fā)酵獲得的生物量達(dá)到最大值，為27.24 g/L，比對(duì)照組提高了51.33%。

圖1 磷酸二氫鉀添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

2.1.2 硫酸鎂添加量對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響

硫酸鎂添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響如圖2 所示。雖然無機(jī)鹽在微生物細(xì)胞中的含量很少，但是能對(duì)其生長(zhǎng)速度和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生一定的影響。鎂是生物體內(nèi)不可或缺的元素，鎂離子能夠激活微生物細(xì)胞體內(nèi)多種酶的活性，能促進(jìn)碳水化合物的新陳代謝、核酸的合成、磷酸鹽的轉(zhuǎn)化等。硫元素是蛋白質(zhì)的重要組成成分，其重要性僅次于磷，對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著至關(guān)重要的作用。隨著液體培養(yǎng)基中硫酸鎂質(zhì)量濃度從0.5 g/L 上升至2.5 g/L，菌絲體的生物量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，菌絲體干重分別為22.12 g/L、23.15 g/L、23.82 g/L、26.33 g/L、24.50 g/L，相比于對(duì)照組的菌絲體干重20.90 g/L 分別提高了5.83%、10.77%、13.97%、25.98%、17.22%，當(dāng)硫酸鎂質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g/L時(shí)，蛹蟲草液體發(fā)酵的菌絲體生物量達(dá)到最大值。

圖2 硫酸鎂添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

2.1.3 維生素B1添加量對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響

維生素B1添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響如圖3 所示。大多數(shù)維生素是微生物生長(zhǎng)代謝過程中某些酶的輔酶，在物質(zhì)代謝中起重要作用。維生素B1廣泛存在于生物體體內(nèi)，參與某些糖和脂肪的代謝過程，在代謝旺盛的位置含量最高。在一定的濃度范圍內(nèi)，添加維生素B1可以顯著促進(jìn)蛹蟲草菌絲體的生長(zhǎng)，獲得更高的產(chǎn)量。當(dāng)維生素B1的添加量為30 mg/L 時(shí)，液體發(fā)酵所得生物量最高，達(dá)到26.07 g/L，較對(duì)照組提高了11.84%。因此，維生素B1的最適添加量為30 mg/L。

圖3 維生素B1 添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

2.1.4 維生素B2添加量對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響

維生素B2添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響如圖4 所示。維生素B2參與微生物體內(nèi)的能量代謝，與碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸和脂肪的生化反應(yīng)息息相關(guān)，是許多動(dòng)物和微生物生長(zhǎng)的必需因素。對(duì)照組搖床震蕩培養(yǎng)發(fā)酵6 d 后，菌絲體生物量為23.52 g/L，在10 mg/L～50 mg/L 的添加范圍內(nèi)，其生物量分別為23.27 g/L、23.91 g/L、24.08 g/L、23.14 g/L、24.25 g/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，維生素B2對(duì)蛹蟲草生物量沒有顯著性的影響，該菌種對(duì)維生素B2生長(zhǎng)因子添加量的變化不敏感。

圖4 維生素B2 添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

2.1.5 維生素B6添加量對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響

圖5 維生素B6 添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

維生素B6添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響如圖5 所示。維生素B6主要以磷酸吡多醛（PLP）形式參與近百種酶反應(yīng)，多數(shù)與氨基酸代謝有關(guān)：包括轉(zhuǎn)氨基、脫羧、側(cè)鏈裂解、脫水及轉(zhuǎn)硫化作用。對(duì)照組搖床震蕩培養(yǎng)發(fā)酵6 d 后，生物量為23.81 g/L，維生素B6在一定程度上能夠促進(jìn)對(duì)蛹蟲草菌絲體的生長(zhǎng)和繁殖。當(dāng)培養(yǎng)基中維生素B6質(zhì)量濃度為40 mg/L 時(shí)，菌絲體產(chǎn)量較對(duì)照組提高了6.93%，此時(shí)促進(jìn)作用最為明顯。

2.1.6 維生素B12 添加量對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響

維生素B12添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響如圖6 所示。維生素B12又稱鈷胺素，參與氨基酸和胸腺嘧啶的合成，能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育。在一定的范圍內(nèi)，添加較低濃度的維生素B12（＜30 mg/L）對(duì)蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較為明顯，能夠獲得更高的生物量。當(dāng)維生素B12的添加量為30 mg/L時(shí)，發(fā)酵所得生物量最多，達(dá)到26.17 g/L，較對(duì)照組菌體產(chǎn)量23.54 g/L 提高了11.17%。隨著液體培養(yǎng)基中維生素B12含量進(jìn)一步增加，菌絲體的生物量逐漸降低。因此，維生素B12的最適添加量為30 mg/L。

圖6 維生素B12 添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)因素與水平

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量影響較大的磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B12添加量這4 個(gè)因素，以發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體干重為指標(biāo)進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn)，正交因素與水平見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B12添加量對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵菌絲體的生物量均有顯著性影響，極差值分別為1.833、1.776、0.836、1.486，4 個(gè)因素對(duì)其響應(yīng)值的影響主次順序?yàn)椋毫姿岫溻浱砑恿浚玖蛩徭V添加量＞維生素B12添加量＞維生素B1添加量。最佳發(fā)酵條件為：磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂2.0 g/L，維生素B130 mg/L，維生素B1230 mg/L。

2.2.3 優(yōu)化條件的驗(yàn)證

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)優(yōu)化出蛹蟲草發(fā)酵菌絲體的最佳工藝（A2B2C2D2）并未在正交試驗(yàn)表中出現(xiàn)，所以需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。液體發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂2.0 g/L，維生素B130 mg/L，維生素B1230 mg/L時(shí)，蛹蟲草菌絲體干重達(dá)到28.23 g/L，高于各試驗(yàn)組所得數(shù)據(jù)，說明工藝優(yōu)化試驗(yàn)有效。

3 結(jié) 論

蛹蟲草菌株可以利用多種B 族維生素作為生長(zhǎng)因子。在液體培養(yǎng)基中添加維生素B1、維生素B6、維生素B12能夠顯著提高菌絲體的生物量；而添加維生素B2對(duì)蛹蟲草菌絲生物量的影響不顯著。

以蛹蟲草液體發(fā)酵菌絲體的生物量為優(yōu)化指標(biāo)，通過四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化蛹蟲草菌絲體發(fā)酵工藝，得到最佳發(fā)酵條件為：磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂2.0 g/L，維生素B130 mg/L，維生素B1230 mg/L，此時(shí)菌絲體產(chǎn)量為28.23 g/L。