肖聰 張懿敏 孫圣榮

[摘要] 目的 研究華蟾素聯(lián)用順鉑對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力、凋亡和細胞周期分布的影響。 方法 體外培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細胞。CCK-8法檢測華蟾素聯(lián)用順鉑對細胞活力的影響;劃痕實驗檢測華蟾素聯(lián)用順鉑對細胞遷移能力的影響;流式細胞術(shù)分析華蟾素聯(lián)用順鉑對細胞凋亡率及細胞周期分布的影響。 結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示，與對照組比較，華蟾素組、順鉑組及華蟾素+順鉑組細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。劃痕結(jié)果顯示，與對照組比較，華蟾素+順鉑組遷移能力顯著下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。流式結(jié)果顯示，與對照組比較，華蟾素+順鉑組G1期比例顯著增多且凋亡更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 華蟾素聯(lián)用順鉑能協(xié)同抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞活力，可能與誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G1期、抑制細胞遷移并促進細胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 華蟾素;順鉑;乳腺癌;MDA-MB-231細胞

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（c）-0012-05

Effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability， apoptosis and cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells

XIAO Cong*? ?ZHANG Yimin*? ?SUN Shengrong

Department of Breast and Thyroid Surgery， Renmin Hosptial of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan? ?430060， China

[Abstract] Objective To study the effects of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability， apoptosis and cell cycle distribution of breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods Breast cancer MDA-MB-231 cells were cultured in vitro. CCK-8 assay was used to detect the effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability. Scratch test was performed to detect the effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell migration. Flow cytometry was used to analyze the effects of cinobufacini combined with Cisplatin on the apoptosis rate and cell cycle distribution of breast cancer cells. Results CCK-8 results showed that compared with the control group， the cell viability in the cinobufacini group， the Cisplatin group and the cinobufacini+Cisplatin group was decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The scratch results showed that the migration ability of the cinobufacini+Cisplatin group was significantly decreased compared with the control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Flow cytometry showed that compared with the control group， the proportion of G1 phase in the cinobufacini+Cisplatin group increased significantly and the apoptosis was more obvious， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Cinobufacini combined with Cisplatin shows a synergic effect in inhibiting MDA-MB-231 cells， which may be related to the induction of cell cycle arrest at G1 phase， inhibition of cell migration and promotion of cell apoptosis.

[Key words] Cinobufacini; Cisplatin; Breast cancer; MDA-MB-231 cell

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年發(fā)病人數(shù)高達167萬例，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1-2]?；熥鳛槿橄侔┚C合治療中至關(guān)重要的一環(huán)，發(fā)揮著抑制癌癥進展、延長生存時間等作用[3]。順鉑作為乳腺癌術(shù)后化療的一線藥物，近年來許多臨床研究表明，鉑類對于復(fù)發(fā)的晚期乳腺癌均有較好的客觀緩解率[4-5]。但與其他化療藥類似，順鉑的不良反應(yīng)表現(xiàn)為骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)毒性、腎臟毒性等，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用[6]。因此尋求通過藥物聯(lián)用降低其使用劑量，從而減少其毒副作用是一種有效的解決手段[7]。華蟾素作為一種中藥，具有活血化瘀、化結(jié)潰堅、利水消腫、清熱解毒等功效[8-9]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素對乳腺癌MDA-MB-231細胞有明顯的抑制作用[10]。徐曉武等[9]研究也發(fā)現(xiàn)，華蟾素能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡，作用機制可能與Bax蛋白表達上調(diào)并向線粒體轉(zhuǎn)位有關(guān)。由此可見，華蟾素確實能有效發(fā)揮抗乳腺癌作用。為了進一步探究華蟾素與傳統(tǒng)化療藥物順鉑是否具有協(xié)同作用，本研究用華蟾素聯(lián)合順鉑處理MDA-MB-231細胞，研究華蟾素聯(lián)用順鉑對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力、凋亡和細胞周期分布的影響，以期為華蟾素聯(lián)合順鉑應(yīng)用于臨床乳腺癌患者的術(shù)后化療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231細胞購自中國科學(xué)院細胞庫上海保藏中心，取5～10代細胞進行實驗。華蟾素（安徽金蟾生化股份有限公司，批號：160904）;順鉑（Sigma公司，批號：1134357）;DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，批號：AC0220191）;胎牛血清（Gibco公司，批號：16000044）;1%雙抗（杭州吉諾公司，批號：31800）;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物科技有限公司，批號：KGA107）;CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號：C0038）。自動酶標(biāo)儀（型號：Tecan Sunrise，Austria）、流式細胞儀（型號：BD FACSCalibur，USA）均來自武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實驗室。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含有10%新生胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖型培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231細胞，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳。取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8實驗

取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，每孔5×103個，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。對照組不進行處理。實驗組分別為：①5、10、20、30、40 μg/mL的華蟾素組;②10、20、40、60、80 μmol/L的順鉑組;③不同濃度的華蟾素+順鉑組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，每孔加入100 μL CCK-8試劑和培養(yǎng)液的混合液（1∶9），避光孵育1 h后，在自動酶標(biāo)儀450 nm波長處測吸光度值A(chǔ)，細胞活力=（A空白組-A處理組）/A空白組×100%。采用兩藥相互作用指數(shù)（coefficient of drug interaction，CDI）評價兩藥相互作用性質(zhì)，CDI的計算公式：CDI=AB/（A×B）。AB為兩藥聯(lián)合使用時與對照組吸光度值的比值，A或B為各藥單獨使用時與對照組吸光度值的比值;當(dāng)CDI<1時，提示兩藥的相互作用為協(xié)同作用;當(dāng)CDI=1時，提示兩藥的相互作用為相加作用;當(dāng)CDI>1時，提示藥物的相互作用為拮抗作用。

1.4 劃痕實驗

將MDA-MB-231細胞以每孔5×104個接種于12孔板中，待細胞長到完全融合后，用無菌100 μL槍頭在12孔板每個孔底劃出“十”字線，PBS洗滌2次，再用倒置顯微鏡拍照，然后在每個孔中加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基。對照組不進行處理。實驗組分別為10 μg/mL華蟾素組、20 μmol/L順鉑組及華蟾素+順鉑組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合度，拍照記錄。

1.5 細胞周期流式分析

取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，每孔5×105個，培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。對照組不進行處理。實驗組分別為10 μg/mL的華蟾素組、20 μmol/L順鉑組及華蟾素+順鉑組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化并收集細胞，1500 r/min離心（r = 10 cm）5 min后，棄上清并用冷PBS洗滌2次，用預(yù)冷的75%乙醇固定過夜。檢測前離心細胞，去掉乙醇，用PBS洗滌2次后，100 μL PBS重懸細胞后加入2 μL濃度為1 mg/mL的核糖核酸酶（RNaseA），37℃水浴40 min后，加入100 μL濃度為100 μg/mL的PI染色液，避光染色20 min后，用流式細胞儀檢測細胞周期的改變。

1.6 細胞凋亡流式分析

同上法處理細胞，取加載結(jié)束后培養(yǎng)24 h的各組細胞，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化細胞并收集，1000 r/min離心（r = 10 cm）5 min后，棄去上清液后用冷PBS洗滌2次，加入500 μL binding buffer重懸細胞后，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育20 min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的改變。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素或順鉑單用對MDA-MB-231細胞活力的影響

CCK-8結(jié)果示：華蟾素濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞活力，其中24 h時，20、30、40 μg/mL華蟾素組與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;48 h時，5、10、20、30、40 μg/mL華蟾素能顯著抑制MDA-MB-231細胞活力（P < 0.05或P < 0.01）;順鉑同樣能以濃度依賴性地方式抑制MDA-MB-231細胞的活力，其中24 h時，20、40、60、80 μg/mL順鉑組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;48 h后，10、20、40、60、80 μg/mL順鉑組能顯著抑制MDA-MB-231細胞的活力（P < 0.05或P < 0.01）。見圖1。

2.2 華蟾素與順鉑單用或聯(lián)用對MDA-MB-231細胞活力的影響

濃度分別為5、10、20、30、40 μg/mL的華蟾素組的細胞活力分別為（91.70±6.41）%、（88.77±2.60）%、（82.27±2.37）%、（73.37±0.71）%、（68.90±1.26）%。濃度分別為10、20、40、60、80 μmol/L的順鉑組的細胞活力分別為（93.87±3.38）%、（91.20±1.53）%、（62.83±4.00）%、（49.57±2.08）%、（48.77±0.95）%。華蟾素（5 μg/mL）+順鉑（10 μmol/L）組的細胞活力為（86.67±4.00）%，CDI為1.007，提示此濃度下，兩藥的相互作用為相加;華蟾素（10 μg/mL）+順鉑（20 μmol/L）組的細胞活力為（68.33±4.32）%，CDI為0.844，提示此濃度下，兩藥對乳腺癌的抑制具有協(xié)同作用;華蟾素（20 μg/mL）+順鉑（40 μmol/L）組的細胞活力為（40.03±3.51）%，CDI為0.774，華蟾素（30 μg/mL）+順鉑（60 μmol/L）組的細胞活力為（29.73±1.62）%，CDI為0.817，華蟾素（40 μg/mL）+順鉑（80 μmol/L）組的細胞活力為（21.43±1.24）%，CDI為0.745。

2.3 華蟾素與順鉑單用或聯(lián)用對MDA-MB-231細胞遷移的影響

48 h后，對照組細胞生長明顯，傷口愈合百分比為（67.2±3.7）%;華蟾素組和順鉑組愈合百分比分別為（53.8±2.4）%、（32.9±2.5）%，與對照組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;華蟾素+順鉑組的細胞生長稀疏，愈合趨勢緩慢，愈合百分比為（4.0±2.6）%，與其他三組比較差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

2.4 華蟾素與順鉑單用或聯(lián)用對MDA-MB-231細胞周期的影響

細胞周期結(jié)果表明，MDA-MB-231細胞經(jīng)順鉑處理24 h后與對照組比較，G1期細胞的比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），而S期細胞比例顯著減少（P < 0.05）;華蟾素組G1期及S期細胞比例與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;而當(dāng)華蟾素與順鉑聯(lián)合用藥時，處于G1期的細胞比例則進一步增加，與對照組及華蟾素組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），但與順鉑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。同時華蟾素+順鉑組的S期細胞比例則進一步減少，與對照組及華蟾素組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），但與順鉑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。四組G2期細胞比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.5 華蟾素與順鉑單用或聯(lián)用對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

細胞凋亡結(jié)果表明，與對照組比較，華蟾素組和順鉑組均能顯著促使MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），華蟾素+順鉑組的促凋亡作用更顯著，與對照組、華蟾素組和順鉑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖4。

3 討論

華蟾素是中華大蟾蜍或黑框蟾蜍的全皮經(jīng)提取加工制成的水溶性制劑，我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為華蟾素具有活血化瘀、化結(jié)潰堅等功效[11-12]。此外，國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究也表明，華蟾素對肝癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和食管癌等腫瘤具有抑制作用[13-16]。由于華蟾素具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng)，能抑制腫瘤生長，目前已廣泛用于臨床上肝癌、肺癌、食管癌和胃癌等腫瘤患者的綜合治療，可改善患者的生存質(zhì)量[17-18]。中藥毒副作用小，并能減輕放化療引起的毒副作用，增強化療藥物的殺傷作用[19-20]，因此華蟾素聯(lián)用化療藥成為熱門研究。尹宜海等[21]研究提示，華蟾素與三氧化二砷聯(lián)用具有協(xié)同抑制結(jié)腸癌細胞的作用，機制可能與p27、Bax蛋白上調(diào)和Bcl-2蛋白下調(diào)有關(guān)，說明華蟾素聯(lián)用化療藥能彼此發(fā)揮協(xié)同作用，從而達到抑制腫瘤的作用。

華蟾素作為一種新型的抗癌藥物，在卵巢癌和骨肉瘤等實體瘤中已證實其與順鉑聯(lián)用具有協(xié)同作用，可達到顯著抑制癌細胞的目的[22-23]，然而在乳腺癌的研究中，這兩藥的相互作用卻鮮有報道，因此本研究著力于探究在乳腺癌中，華蟾素與順鉑聯(lián)用是否能協(xié)同抑制乳腺癌。本研究提示，華蟾素與順鉑均能濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞活力，當(dāng)10 μg/mL華蟾素聯(lián)用20 μmol/L順鉑時，在抑制乳腺癌細胞的過程中發(fā)揮協(xié)同作用[24]，但隨著藥物濃度的增加，協(xié)同作用并未發(fā)生顯著提升，提示華蟾素聯(lián)用順鉑能在較低濃度下發(fā)揮協(xié)同作用，并且不隨濃度的增加而增加。隨后，本研究分析了華蟾素與順鉑單用或聯(lián)用對細胞周期分布的影響，結(jié)果提示，華蟾素或順鉑單用時，均能導(dǎo)致G1期細胞比例增加，兩者聯(lián)用時，G1期細胞比例則進一步顯著增加，說明華蟾素或順鉑單用均能導(dǎo)致細胞周期阻滯于G1期，兩藥聯(lián)用時，則使這種阻滯效果更加明顯。細胞凋亡結(jié)果提示，華蟾素或順鉑單用時均能誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，當(dāng)兩者聯(lián)合應(yīng)用時，凋亡細胞比例則進一步顯著增加，說明兩藥聯(lián)合應(yīng)用比單一用藥誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用更加顯著。

本研究初步證實華蟾素與順鉑具有協(xié)同抑制MDA-MB-231細胞的作用，可能與協(xié)同誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞周期阻滯于G1期、抑制遷移及促進其凋亡有關(guān)，本研究將進一步深入展開研究華蟾素聯(lián)用順鉑抑制乳腺癌的分子機制，為華蟾素聯(lián)合順鉑用于臨床乳腺癌患者的治療提供參考。

[參考文獻]

[1]? Yu X，Zhou S，Wang J，et al. Hormone replacement therapy and breast cancer survival：a systematic review and meta-analysis of observational studies [J]. Breast Cancer，2017，24（5）：643-657.

[2]? Mavaddat N，Pharoah PD，Michailidou K，et al. Prediction of breast cancer risk based on profiling with common genetic variants [J]. J Natl Cancer Inst，2015，107（5）：5-8.

[3]? 包中會，陳燕，任洪波，等.三陰乳腺癌術(shù)后輔以密集化療的臨床療效[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016，24（14）：2221-2224.

[4]? 詹穎，童遠和，陳志勇，等.吉西他濱聯(lián)合順鉑與多西他賽聯(lián)合順鉑在晚期三陰乳腺癌化療中的對比研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（17）：67-69.

[5]? 丘惠珍，李亮，楊權(quán)烈，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合順鉑治療乳腺癌惡性胸腔積液療效觀察[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2018，8（9）：170-173.

[6]? 李瑞霞.吉西他濱與長春瑞濱分別聯(lián)合順鉑治療晚期乳腺癌的近期療效及不良反應(yīng)分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014，43（7）：861-863.

[7]? 李惠，沈凱凱.中藥抗腫瘤聯(lián)合用藥研究進展[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，31（3）：90-94.

[8]? 許雷來，郎雅麗，謝璐帆，等.華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細胞E-cad、N-cad表達的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，27（2）：107-109.

[9]? 徐曉武，楊小敏，金洲祥，等.華蟾素誘導(dǎo)人乳腺癌細胞株MCF-7細胞凋亡與Bax/Bcl-2的關(guān)系[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2012，18（6）：580-583.

[10]? 鄭迪，代國，張政佩，等.華蟾素對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖遷移凋亡的影響[J].中國現(xiàn)代中藥，2018， 20（4）：409-414.

[11]? 朱晨宇，王廣勝，楊振華，等.華蟾素對直腸癌SW480細胞生長影響的實驗研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016，24（15）：2356-2359.

[12]? 湯偉，胡凱文.華蟾素抗惡性腫瘤的臨床應(yīng)用進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，23（12）：41-44.

[13]? 孫宇，單路娟，劉越堅，等.華蟾素注射液對人肝癌HepG-2細胞增殖及凋亡的影響[J].中國腫瘤，2010，19（6）：410-413.

[14]? 沈欣，原翠林.華蟾素對結(jié)腸癌細胞SW480生物學(xué)行為的影響[J].中國醫(yī)療前沿，2011，6（14）：7-8.

[15]? 史東梅，陳方基，于麗麗.不同濃度的華蟾素對卵巢癌3AO細胞MMP-2和TIMP-2表達的影響及可行性研究[J].中國醫(yī)療前沿，2010，5（17）：73-74.

[16]? 楊興肖，馬鳴，單保恩，等.華蟾素注射液對人食管癌細胞增殖、侵襲和化療敏感性的影響及其機制[J].癌變·畸變·突變，2017，29（2）：96-101.

[17]? 袁梅美，惠起源.華蟾素抗惡性腫瘤的研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，11（2）：44-46.

[18]? 姜秋雯，陳濤.華蟾素抗惡性腫瘤的機制及不良反應(yīng)的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（11）：2737-2739.

[19]? 曾德貴，陳保安，吳尚，等.柚皮素對人肺鱗癌NCI-H2170細胞增殖、凋亡的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2018， 15（8）：4-8.

[20]? 白若冰，荔志云，任海軍，等.中醫(yī)中藥在腦膠質(zhì)瘤治療中的作用研究[J].西部中醫(yī)藥，2018，31（1）：134-137.

[21]? 尹宜海，劉霞，張守成.華蟾素聯(lián)合三氧化二砷對結(jié)腸癌細胞的作用[J].江蘇醫(yī)藥，2017，43（15）：1062-1065.

[22]? 王成雙，佐滿珍.華蟾素聯(lián)合順鉑對卵巢癌細胞A2780增殖及凋亡的影響[J].腫瘤學(xué)雜志，2017，23（1）：30-34.

[23]? 代國，陶春杰，鄭迪，等.華蟾素聯(lián)合順鉑對人骨肉瘤U2OS細胞增殖和凋亡的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2017，17（30）：5812-5817.

[24]? 許曉峰，楊瑋，張學(xué)進，等.茅莓總皂苷聯(lián)合化療藥通過Fas途徑協(xié)同誘導(dǎo)白血病HL-60細胞凋亡研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（4）：923-926.