宋振，張衍雷，付衛(wèi)東，張瑞海，張國(guó)良

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081

少花蒺藜草在分類學(xué)上屬于禾本科（Gramineae）、蒺藜草屬（Cenchrussp.），原產(chǎn)于北美洲及熱帶沿海地區(qū)（Matocha et al.，2010；周立業(yè)等，2014）。少花蒺藜草可以作為一種牧草，然而其刺苞表面密被許多小刺，因此會(huì)對(duì)人及牲畜造成傷害，影響農(nóng)牧生產(chǎn)。少花蒺藜草適應(yīng)性強(qiáng)，具有耐旱、抗寒、耐貧瘠和繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，尤其在沙漠地帶也可以生長(zhǎng)繁衍，對(duì)沙漠化治理和生態(tài)恢復(fù)建設(shè)具有重要的意義；同時(shí)其適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖擴(kuò)散快的特點(diǎn)也會(huì)使其入侵到農(nóng)田和牧場(chǎng)造成危害，成為一種很難根絕的雜草（張婷等，2017；張衍雷等，2015）。少花蒺藜草大約在20世紀(jì)40年代后期入侵到中國(guó)，但其入侵原因尚不確定，有學(xué)者認(rèn)為是在二戰(zhàn)期間由日本人在東北地區(qū)墾殖時(shí)人為帶入，還有觀點(diǎn)認(rèn)為少花蒺藜草是在中國(guó)北方進(jìn)行牧草引種時(shí)隨貨物流入（安瑞軍等，2015；齊鳳林等，2011）。少花蒺藜草入侵后迅速繁殖蔓延，目前在中國(guó)北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶干旱半干旱沙地分布廣泛。很多研究人員發(fā)現(xiàn)，在此地區(qū)的蒺藜草屬雜草根據(jù)表型主要分為兩種：一種直立生長(zhǎng)（直立型），一種匍匐生長(zhǎng)（匍匐型）。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)這兩種類似的蒺藜草屬植物是否為同一物種觀點(diǎn)不一，甚至對(duì)少花蒺藜草稱謂和拉丁名也存在爭(zhēng)議，有人認(rèn)為是同一物種的不同表型變異，也有人認(rèn)為為同一屬的兩個(gè)不同種（安瑞軍，2013；徐軍等，2011）?！吨袊?guó)植物志》（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志委員會(huì)，1990）等權(quán)威文獻(xiàn)中關(guān)于蒺藜草屬植物形態(tài)學(xué)的具體細(xì)節(jié)描述認(rèn)為，入侵中國(guó)北方地區(qū)的兩種表型蒺藜草屬植物分別為少花蒺藜草（C.spinifex）和蒺藜草（C.echinatus），是不同的兩個(gè)種。兩種植物的表型差異主要有以下兩點(diǎn)：（1）蒺藜草植株無分蘗或分蘗較少，表現(xiàn)為直立生長(zhǎng)，而少花蒺藜草植株分蘗數(shù)量較多，表現(xiàn)為匍匐生長(zhǎng)；（2）蒺藜草刺苞上剛毛輪狀著生，刺苞背部具較密的細(xì)毛和長(zhǎng)綿毛，而少花蒺藜草刺苞幾乎無毛。但是表型的差異可能是由于環(huán)境因素等條件造成的，并不能完全確定二者是否為相同的種。

入侵生物的種類和數(shù)量具有顯著的地理區(qū)域性和時(shí)間動(dòng)態(tài)性，而同一物種在不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生較大的表型可塑性差異（齊艷紅等，2004；黃成成等，2018）。研究入侵植物的不同地理種群的種類和進(jìn)化特征的手段多種多樣，除了常規(guī)利用形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)和生理生化方法外，分子生物學(xué)手段也發(fā)揮著重要作用。近年來，DNA條形碼（DNA barcode）技術(shù)在植物分類鑒定中的應(yīng)用越來越廣泛（寧淑萍等，2008；任保青等，2010）。DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段，目前最常用的是ITS、rbcL、trnH-psbA等基因序列。這些序列具有長(zhǎng)度高度保守性等特點(diǎn)，可以較好的用來進(jìn)行生物種群的分類研究（Baldwin，1992；Group，2009；Kress et al.，2007；Wang et al.，2010）。另外一種常用的方法是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記法（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）（Lynch et al.，2010；Powell et al.，1996）。該方法于上世紀(jì)90年代初誕生，是建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于生物的品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究上。利用上述分子生物學(xué)手段來進(jìn)行生物遺傳多樣性、生態(tài)型進(jìn)化等分析是一種可靠快速的方法，尤其對(duì)入侵物種的擴(kuò)散途徑和種群分類進(jìn)化等方面的研究具有重要的應(yīng)用意義。

目前對(duì)中國(guó)北方地區(qū)分布的不同地理種群少花蒺藜草的入侵、擴(kuò)散和進(jìn)化等研究報(bào)道較少，尤其兩種不同表型的蒺藜草屬植物的種群差異和進(jìn)化分類學(xué)研究尚未見報(bào)道。本研究利用ITS、rbcL、trnH-psbA等序列保守和變異的特點(diǎn)對(duì)中國(guó)北方地區(qū)兩種表型的蒺藜草屬植物進(jìn)行進(jìn)化差異分析，并結(jié)合其生物學(xué)特性來確定其物種分類學(xué)地位。同時(shí)采用RAPD技術(shù)對(duì)來源于中國(guó)北方不同地理區(qū)域的少花蒺藜草種群遺傳多樣性進(jìn)行了分析，初步摸索了少花蒺藜草在北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶干旱半干旱地區(qū)的擴(kuò)散傳播路徑及種群遺傳多樣性特點(diǎn)，以期為揭示少花蒺藜草入侵機(jī)制、防治少花蒺藜草的危害提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

圖1 不同地理種群采樣點(diǎn)分布圖 Fig. 1 Distribution map of sampling points of different geographical populations

在中國(guó)北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶地區(qū)選取蒺藜草屬雜草（包括直立型和匍匐型兩種表型）入侵較為嚴(yán)重的16個(gè)地理種群進(jìn)行取樣，收集這些樣本的成熟種子及植物葉片。具體地理種群和命名見圖1所示，16個(gè)取樣點(diǎn)具體信息為：內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗（AH-A，42°28.935′N，119°20.353′E；AH-B，41°99.307′N，120°07.978′E；AH-C，42°47.007′N，120°52.357′E）、遼寧省朝陽市（CY，41°32.050′N，120°27.301′E）、遼寧省錦州市凌?？h（LH，41°18.541′N，121°27.301′E）、遼寧省錦州市易縣（YX，41°32.878′N，121°14.651′E）、遼寧省阜新市彰武縣（ZW，42°48.454′N，121°58.608′E）、內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)大林鎮(zhèn)（TL-Ⅰ，43°43.691′N，122°41.191′E）通遼市科爾沁左翼后旗金寶屯鎮(zhèn)（TL-Ⅱ，43°22.596′N，123°29.339′E）通遼市科爾沁左翼后旗（TL-Ⅲ，43°00.867′N，122°25.094′E）、內(nèi)蒙古通遼市庫倫旗澳倫新村（TL-Ⅳ，42°48.454′N，121°58.608′E）、內(nèi)蒙古通遼市科爾沁左翼中旗小努 日 木村（TL-Ⅴ，43°96.938′N，123°10.286′E）、內(nèi)蒙古通遼市科爾沁左翼中旗花吐古拉鎮(zhèn)（TL-Ⅵ，43°86.697′N，122°8.384′E）、內(nèi)蒙古通遼市四合 屯 牧場(chǎng)（TL-Ⅶ，43°39.292′N，122°03.710′E）、內(nèi)蒙古通遼市開魯縣大泡子村（TL-Ⅷ，43°31.583′N，121°28.904′E）、內(nèi)蒙古通遼市奈曼旗八仙筒鎮(zhèn)（TL-Ⅸ，43°11.857′N，121°15.469′E）。擴(kuò)增DNA條形碼保守序列及RAPD分析的材料取自兩種不同表型的植物葉片組織。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

將采集的種子播種于光照培養(yǎng)箱，溫度設(shè)定白天30 ℃，夜間20 ℃，光照周期16 h。取出苗后生長(zhǎng)14 d的幼苗葉片組織，采用改良CTAB方法提取植物樣本總DNA（Stewart，1993；王濤等，2017）。

利用ND5000超微量紫外分光光度計(jì)（Beijing BioTeke Corporation）測(cè)定DNA純度和濃度，將DNA提取液稀釋至終濃度30 ng·μL-1待用。

1.2.2 DNA條形碼分析

采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法分別擴(kuò)增ITS、rbcL、trnH-psbA基因序列（Baldwin，1992；Group，2009；Kress et al.，2007；Wang et al.，2010）。

ITS擴(kuò)增通用引物ITS5（上游引物，5′GGAA GTAA AAGT CGTA ACAAGG3′）和ITS4（下游引物，5′TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC3′）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：10×Buffer（含2 mM Mg2+）12.5 μL，正反引物各1 μL，0.12 mM dNTPs 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃，5 min；變性94 ℃，1 min；復(fù)性54 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min；共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

rbcL引物序列為：1F：ATGTCACCACAAAC AGAAAC，724R：TCGCATGTACCTGCAGTAGC，25 μL反應(yīng)體系：10×Buffer（含2 mM Mg2+）12.5 μL，正反引物各1 μL，0.12 mM dNTPs 2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃，4 min；變性94 ℃，30 s；復(fù)性53 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min；共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

trnH-psbA引物序列為：psbA(F)：CTTATGCAT GAACGTAATGCTC，trnH2(R)：CGCGCGCATGGT GATTCACAATCC。25 μL反應(yīng)體系：10×Buffer（含2 mM Mg2+）12.5 μL，正反引物各1 μL，0.12 mM dNTPs 2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃，4 min；變性94 ℃，30 s；復(fù)性53 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min；共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 RAPD分析

RAPD隨機(jī)引物購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。利用這些引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，對(duì)條帶清晰試驗(yàn)進(jìn)行至少3次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，包括10×Buffer（含2 mM Mg2+）2.5 μL，0.2 mM引物1 μL，0.12 mM dNTPs 1μL，1 U Taq DNA聚合酶，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，36 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸5 min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)不含模板DNA的空白對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理主要參照文獻(xiàn)所述方法（Nei et al.，1979），將RAPD電泳譜帶位點(diǎn)上有擴(kuò)增位點(diǎn)的記為1，無擴(kuò)增位點(diǎn)的記為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，用Pop Gene 32、NTsys 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。主要數(shù)據(jù)指標(biāo)為：群體的多態(tài)位點(diǎn)百分率P=擴(kuò)增的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/擴(kuò)增的總位點(diǎn)數(shù)×100%、Nei’s基因多樣性（He）、Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)（H0）、Nei’s遺傳一致度（I）和遺傳距離（D）的參數(shù)分析；最后用NTsys 2.1軟件進(jìn)行基于遺傳距離的聚類分析，構(gòu)建親緣進(jìn)化遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種不同表型蒺藜草屬植物的分類學(xué)鑒定

入侵中國(guó)北方地區(qū)的蒺藜草屬植物分布著許多地理生態(tài)群，主要包括兩種表型：直立型和匍匐型。這兩種表型的蒺藜草屬植物外形上存在較大的區(qū)別，直立型相比匍匐型具有較大的葉片、莖直立、株高較高和一級(jí)分蘗數(shù)高，但是單株種子量和二級(jí)分蘗數(shù)低（圖2）。通過DNA條形碼保守序列差異分析進(jìn)一步確定這兩種不同表型的植物在分類學(xué)上的地位。3種保守序列引物PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖3顯示，兩種表型的蒺藜草屬植物均得到單一的特異擴(kuò)增條帶。對(duì)擴(kuò)增的條帶進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)（圖4）。其中，兩種表型的蒺藜草屬植物的ITS序列比對(duì)結(jié)果均與Khan S報(bào)道的蒺藜草（C.echinatus）[NCBI登錄號(hào)Sequence ID: gb|KF850611.1|]關(guān)系最近，序列相似度 均為99%。而兩種蒺藜草屬的保守序列之間相似度也為99%。因此筆者綜合判斷得出，入侵中國(guó)北方地區(qū)的兩種表型蒺藜草屬植物均為少花蒺藜草（C.spinifex）。造成兩種表型差異的原因可能與光照、溫度、水分等不同環(huán)境因素的長(zhǎng)期影響有關(guān)。對(duì)于少花蒺藜草的拉丁名，目前也有多種表述。筆者根據(jù)文獻(xiàn)資料，并沿用目前國(guó)際上較為通用的說法（Simon，2010；張婷等，2017），建議統(tǒng)一使用C.spinifex作為少花蒺藜草的拉丁名。

圖2 少花蒺藜草的兩種不同表型差異 Fig. 2 Differences between the two phenotypic types of C. spinifex

圖3 兩種表型的蒺藜草屬植物DNA條形碼保守序列擴(kuò)增電泳圖 Fig. 3 Amplified electrophoresis of DNA barcode conservative sequences of the two phenotypic types

圖4 兩種表型的植物保守序列在NCBI的比對(duì)結(jié)果 Fig. 4 Comparison of DNA barcode sequences of the two phenotypic types in NCBI

2.2 入侵中國(guó)北方地區(qū)不同地理種群少花蒺藜草的進(jìn)化關(guān)系分析

對(duì)200條RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選，其中有12條引物能夠擴(kuò)增出清楚、多態(tài)性明顯的條帶，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為200-2000 bp的條帶37個(gè)，其中具有多態(tài)性的有35個(gè)。擴(kuò)增結(jié)果表明不同引物所擴(kuò)增出的譜帶數(shù)不同，不同材料之間的擴(kuò)增帶數(shù)存在多態(tài)性。對(duì)12條引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1，多態(tài)性條帶比率（P）為94.59%，每條引物的多態(tài)性位點(diǎn)在2-4個(gè)之間，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出3.08個(gè)位點(diǎn)。各條帶均有較大的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)及Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)，反應(yīng)了各個(gè)樣點(diǎn)之間存在豐富的多態(tài)性。

采用Nei’s遺傳一致度（I）和遺傳距離（D）對(duì)入侵中國(guó)北方地區(qū)不同少花蒺藜草種群遺傳進(jìn)化程度進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。16個(gè)地理種群中，樣點(diǎn)TL-Ⅵ與的樣點(diǎn)TL-Ⅷ遺傳一致度最高，遺傳距離最近（I=0.8919，D=0.1144），親緣關(guān)系近；而樣點(diǎn)TL-Ⅵ與樣點(diǎn)TL-Ⅲ、樣點(diǎn)AH-A與樣點(diǎn)YX及樣點(diǎn)YX與樣點(diǎn)TL-Ⅱ 3組的遺傳距離遠(yuǎn)，親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。樣點(diǎn)AH-C與其他各樣點(diǎn)遺傳距離均較遠(yuǎn)。

表1 12條隨機(jī)引物的擴(kuò)增結(jié)果（5′-3′） Table 1 The amplification results of 12 random primers (5′-3′)

為了進(jìn)一步確立這16個(gè)地理種群的親緣進(jìn)化關(guān)系，基于Nei’s遺傳距離來構(gòu)建UPGMA聚類圖譜（圖5）。當(dāng)遺傳相似度閾值為0.6時(shí)，可將16個(gè)地理種群劃分成5個(gè)類，即內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗西部地區(qū)、通遼市奈曼旗、通遼市左翼中旗樣本；通遼市庫倫旗樣本；通遼市科爾沁左翼后旗、遼寧省朝陽市、彰武縣樣本；凌海市、易縣樣本；以及赤峰市敖漢旗北部地區(qū)。當(dāng)遺傳距離閾值為0.79時(shí)，可基本將所有地理種群分開。

表2 種群遺傳一致度和遺傳距離 Table 2 Nei's original measures of genetic identity and genetic distance

圖5 中國(guó)北方地區(qū)不同地理種群的少花蒺藜草UPMGA聚類圖 Fig. 5 UPGMA dendrogram for the 16 population based on Nei’s genetic distance

通過上面的分析，我們可以初步判斷出中國(guó)北方地區(qū)少花蒺藜草的入侵路線。研究結(jié)果表明，赤峰市敖漢旗所取的3個(gè)樣點(diǎn)少花蒺藜草入侵途徑不同。南部地區(qū)（AH-B）少花蒺藜草與遼寧省朝陽市的樣本親緣關(guān)系較近（D=0.4754），北部地區(qū)（AH-A）與通遼市奈曼旗的樣本親緣較近（D=0.4329）。遼寧省凌海市與易縣兩地的少花蒺藜草親緣關(guān)系較近（D=0.392），而易縣的樣本又與彰武縣的樣本親緣關(guān)系較近（D=0.5199），同時(shí)，彰武縣與通遼市左翼后旗樣點(diǎn)間的遺傳距離也相對(duì)較小，通遼市境內(nèi)的各個(gè)取樣點(diǎn)之間的關(guān)系也可以根據(jù)遺傳距離明確。因此我們判斷，入侵內(nèi)蒙古、遼寧地區(qū)的少花蒺藜草傳播擴(kuò)散路徑有兩條主線，一條是凌海-易縣-彰武-通遼市左翼后旗—通遼市左翼中旗，同時(shí)彰武地區(qū)的少花蒺藜草又?jǐn)U散到朝陽市、通遼市左翼后旗地區(qū)擴(kuò)散到庫倫旗；另一條為通遼市左翼中旗-開魯縣-奈曼旗-赤峰市敖漢旗，同時(shí)庫倫旗的少花蒺藜草也向敖漢旗方向擴(kuò)散。

3 討論

3.1 入侵中國(guó)北方地區(qū)的蒺藜草屬植物分類學(xué)地位

對(duì)于入侵中國(guó)北方地區(qū)的少花蒺藜草的分類地位觀點(diǎn)不一，爭(zhēng)論不休。如徐軍等（2011）認(rèn)為，入侵地的蒺藜草應(yīng)為光梗蒺藜草（C.incertus）；而安瑞軍（2013）認(rèn)為，入侵地的少花蒺藜草為一個(gè)新種，拉丁名應(yīng)為C.pauciflorus。兩篇報(bào)道皆在總結(jié)前人文獻(xiàn)，僅根據(jù)表型特征得出的推論，這種分類學(xué)混亂的局面不利于對(duì)少花蒺藜草的入侵機(jī)制的研究及防治技術(shù)的開發(fā)。因此，本研究根據(jù)入侵中國(guó)北方的兩種不同表型植物的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合《中國(guó)植物志》的描述，初步判斷其均應(yīng)為蒺藜草屬（Cenchrussp.）植物，又利用更為精確的分子生物學(xué)方法，通過對(duì)兩種表型的蒺藜草屬植物（直立型和匍匐型）的ITS等保守序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序和比較分析，判定這兩種表型的蒺藜草屬植物均為少花蒺藜草（C.spinifex）。根據(jù)筆者所在團(tuán)隊(duì)多年的調(diào)查研究結(jié)果顯示，匍匐型少花蒺藜草主要在中國(guó)北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶干旱半干旱沙地分布，而直立型少花蒺藜草在中國(guó)分布范圍較廣，從東北地區(qū)、東部沿海，直到海南島均有分布。這可能與不同環(huán)境條件下表型的變異有關(guān)，這也與《中國(guó)植物志》中關(guān)于兩種表型植物的分布規(guī)律描述一致（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志委員會(huì)，1990）。

3.2 中國(guó)北方地區(qū)少花蒺藜草的地理種群遺傳多樣性及傳播擴(kuò)散路徑分析

利用RAPD技術(shù)能夠有效地對(duì)一些物種進(jìn)行遺傳多樣性分析，這種分子生物學(xué)手段從DNA序列變異和進(jìn)化水平來分析生物種群之間的進(jìn)化地位差異，所獲得的結(jié)果較為客觀和真實(shí)，該方法可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物和微生物的分類鑒定研究（Jones et al.，2015；Lynch et al.，2010；Powell et al.，1996；Shiue et al.，2015；Stewart et al.，1993）。目前，國(guó)內(nèi)已有較多報(bào)道利用RAPD技術(shù)分析研究不同糧食作物及經(jīng)濟(jì)作物的遺傳多樣性（林新春等，2003；肖猛等，2015；徐影等，2013；翟亞輝等，2013），但是對(duì)于入侵植物少花蒺藜草的分類及進(jìn)化地位方面還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過RAPD技術(shù)對(duì)入侵中國(guó)北方地區(qū)的少花蒺藜草不同地理種群進(jìn)行比對(duì)研究，發(fā)現(xiàn)其具有豐富的遺傳多樣性特點(diǎn)。

少花蒺藜草種子可通過農(nóng)具、動(dòng)物攜帶、水流等方式迅速向外擴(kuò)散傳播，加上其自身所具有的耐旱、抗寒、耐貧瘠及繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在中國(guó)北方地區(qū)形成了不同的地理種群。對(duì)這些地理種群的遺傳變異和進(jìn)化進(jìn)行研究，可以揭示少花蒺藜草在中國(guó)北方地區(qū)的入侵路線，有利于對(duì)其入侵、傳播和危害的遏制（張衍雷等，2015；張志新等，2015）。本研究結(jié)果初步描繪了中國(guó)北方地區(qū)入侵少花蒺藜草的入侵傳播路線。從傳播路徑圖上可以看出，少花蒺藜草的主要擴(kuò)散方式是跨區(qū)域車輛運(yùn)輸活動(dòng)，如凌海-左翼中旗路線主要是沿G101和G304國(guó)道進(jìn)行，敖漢旗-左翼中旗路線主要沿G111國(guó)道進(jìn)行。所以，加強(qiáng)地區(qū)間的檢疫工作是防止少花蒺藜草擴(kuò)散蔓延的重要手段。另外一種人為擴(kuò)散方式是少花蒺藜草種子隨貨物夾雜或隨牧草引種傳播。本研究發(fā)現(xiàn)，凌海市的少花蒺藜草可能是內(nèi)蒙古、遼寧地區(qū)少花蒺藜草傳播的源頭。由于凌海市緊鄰錦州市，不排除少花蒺藜草種子可能是隨進(jìn)出口貨物或牧草引種而帶入的，隨后向其他各地傳播。然而，本研究并未對(duì)錦州地區(qū)及其他周邊地區(qū)的少花蒺藜草進(jìn)行分析，也未采集國(guó)外少花蒺藜草的生物樣本，所以具體推論還仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析，采用DNA條形碼技術(shù)，研究了中國(guó)北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶地區(qū)兩種表型的蒺藜草屬雜草的分類學(xué)地位，通過保守序列測(cè)序和分析比對(duì)，確定了兩種不同表型（直立型、匍匐型）植物均為少花蒺藜草（C.spinifex）。采用RAPD技術(shù)對(duì)來源于不同地理區(qū)域的少花蒺藜草種群遺傳多樣性進(jìn)行了分析，構(gòu)建了親緣進(jìn)化遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)入侵中國(guó)東北三省及內(nèi)蒙古地區(qū)的少花蒺藜草沿不同國(guó)道方向的傳播主線主要有兩條：一條是凌海-易縣-彰武-通遼市左翼后旗-通遼市左翼中旗，同時(shí)彰武地區(qū)的少花蒺藜草又?jǐn)U散到朝陽市、通遼市左翼后旗地區(qū)擴(kuò)散到庫倫旗；另一條為通遼市左翼中旗-開魯縣-奈曼旗-赤峰市敖漢旗，同時(shí)庫倫旗的少花蒺藜草也向敖漢旗方向擴(kuò)散。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示少花蒺藜草入侵的生態(tài)學(xué)機(jī)制奠定了理論依據(jù)。