雍艷紅，于天月，張 騫，李俊玉，方 彪，吳蓮云，胡燦穎，巨向紅*

(1.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東深圳518108；2.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東湛江524088；3.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，廣東湛江524088)

熱應(yīng)激可致豬采食量下降、腸絨毛變短、隱窩變淺、粘膜損傷和腹瀉[1]，出現(xiàn)典型的炎性腸病(IBD)特征。隨后的研究顯示，熱應(yīng)激豬腸道細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高，細(xì)胞凋亡大量出現(xiàn)，腸道黏膜完整性損傷明顯[2]。但這些病變發(fā)生的分子機(jī)理尚不清楚，阻礙了防控措施的進(jìn)一步實(shí)施。

糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)主要存在于細(xì)胞漿中，在不與糖皮質(zhì)激素(GC)結(jié)合時(shí)，能夠與兩分子的熱休克蛋白90 (Heat shock protein 90，HSP90)結(jié)合形成復(fù)合體，此時(shí)GR 的DNA結(jié)合區(qū)被HSP90 覆蓋，不能發(fā)揮生理作用[3]。前期發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激上調(diào)豬血漿GC 的表達(dá)，但腸道炎癥過(guò)程依然增強(qiáng)，推測(cè)熱應(yīng)激可能調(diào)節(jié)了腸道GR 的表達(dá)而影響了GC 的抗炎效應(yīng)。本研究檢測(cè)了熱應(yīng)激豬腸道GR 的分布及表達(dá)水平，為進(jìn)一步闡述熱應(yīng)激誘發(fā)豬炎性腸病的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)樣品采集 48 頭2 月齡健康土雜豬(杜洛克♂×雷州黑豬♀)購(gòu)自湛江某豬場(chǎng)，平均體重15±2 kg。購(gòu)買(mǎi)后于環(huán)境溫度20±3 ℃、相對(duì)濕度70 %～80 %的動(dòng)物房適應(yīng)14 d。全價(jià)飼料飼喂，每日早、中、晚各1 次，自由飲水。受試動(dòng)物隨機(jī)分為2 組(實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組)，每組24 頭。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，熱應(yīng)激組飼養(yǎng)于環(huán)境溫度為35±1 ℃的人工氣候溫室。分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的第1 d、7 d、14 d 和21 d 頸動(dòng)脈放血迫殺受試動(dòng)物，采集其十二指腸、盲腸和結(jié)腸組織，PBS 漂洗3 次，液氮凍存后轉(zhuǎn)-80 ℃保存，用于總蛋白提取。取結(jié)腸、十二指腸和盲腸組織，10 %的福爾馬林溶液固定待用。

1.2 主要試劑 GR (L224)多克隆抗體購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司；羊抗兔HRP-IgG、小鼠抗人β-actin 多克隆抗體和抗體稀釋液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑、RIPA 細(xì)胞裂解液、BCA 微量蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光液均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)GR 分布特征 取福爾馬林固定的腸道組織，常規(guī)方法制作石蠟切片。檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，PBS 沖洗3 次，免疫染色強(qiáng)力通透液作用5 min，3 %過(guò)氧化氫避光孵育10 min，PBS 漂洗3 次，1 %牛血清封閉60 min，加入Anti-GR (L224)多克降抗體(1∶250)于4 ℃過(guò)夜孵育，TBS漂洗3 次，加入羊抗兔HRP-IgG (1∶2 000)于37 ℃孵育30 min，DAB 顯色5 min～10 min，蘇木精復(fù)染1 min，1 %鹽酸酒精分化1 s～2 s，流水沖洗，封片，顯微鏡下觀察GR 的分布。

1.4 Western blot 檢測(cè)GR 表達(dá)量 稱取50 mg 腸道組織經(jīng)裂解法提取組織全蛋白，利用BCA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后與5×Loading buffer 以1:4 比例混勻，100 ℃變性5 min 后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。以小鼠抗人β-actin 多克隆抗體(1∶1 000)、Anti-GR (L224)多克隆抗體(1∶250)為一抗，羊抗兔HRP-IgG 為二抗(1∶2 000)，進(jìn)行western blot 檢測(cè)。采用Image J 軟件分析灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量，用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 GR 分布特征的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果雙盲法對(duì)GR 在各腸段的表達(dá)進(jìn)行判定。結(jié)果顯示，熱應(yīng)激第1 d，實(shí)驗(yàn)組豬盲腸粘膜層GR 的表達(dá)量顯著降低；熱應(yīng)激第14 d，在實(shí)驗(yàn)組豬盲腸和結(jié)腸的粘膜層中GR 的表達(dá)量較對(duì)照組升高；實(shí)驗(yàn)組豬十二指腸的GR 表達(dá)量在熱應(yīng)激的第7 d 和14 d 的表達(dá)顯著升高(表1、圖1)。

GR 是轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族的成員[4-5]，對(duì)GC的生理功能起負(fù)調(diào)節(jié)作用[6]。Raddatz 等檢測(cè)了潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病患者腸道GR 的分布，發(fā)現(xiàn)其主要分布于結(jié)腸的隱窩、上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中[7]。馬偉慧等人研究了全氟辛酸(PFOA)對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥、外周血炎癥介質(zhì)IL-4、IFN-γ 以及肺組織GR表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)GR 蛋白表達(dá)在支氣管上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)較多[8]。本研究檢測(cè)了熱應(yīng)激條件下豬腸道GR 的分布與表達(dá)情況，表明GR 主要表達(dá)于腸道組織的粘膜層，這可能由于黏膜層與腸腔中的食糜和微生物等抗原物質(zhì)距離較近，從而參與了腸道穩(wěn)態(tài)維持過(guò)程有關(guān)。

2.2 GR 表達(dá)量的western blot 檢測(cè)結(jié)果 Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組豬十二指腸的GR 表達(dá)量顯著上調(diào)(p＜0.05)，且在熱應(yīng)激第14 d 達(dá)峰值。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組豬結(jié)腸的GR 表達(dá)量也顯著上調(diào)(p＜0.05)，第14 d 達(dá)峰值，實(shí)驗(yàn)組豬盲腸的GR 表達(dá)量顯著降低(p＜0.05)(圖2)。

表1 熱應(yīng)激豬腸道GR 的分布特征Table 1 Characteristic of GR distribution in intestinal gut of heat stressed pigs

圖1 熱應(yīng)激豬腸道粘膜層GR 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(200x)Fig.1 The results of immunohistochemical staining for intestinal gut of heat stressed pigs in mucous layer (200x)

據(jù)報(bào)道，在熱應(yīng)激條件下HSP90 mRNA 表達(dá)量增加，同時(shí)雞外周血淋巴細(xì)胞中GR mRNA 的表達(dá)量也出現(xiàn)增加趨勢(shì)，由此推測(cè)GR 可能參與了熱應(yīng)激的調(diào)節(jié)過(guò)程。趙紅波等研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激下雞GC 表達(dá)量升高，而GC 表達(dá)量過(guò)高會(huì)破壞淋巴細(xì)胞，為抵御淋巴細(xì)胞的過(guò)度破壞，機(jī)體下調(diào)了GR表達(dá)量，但作者均沒(méi)有檢測(cè)GR 蛋白的表達(dá)水平[9]。另外，在炎熱氣候條件下母豬妊娠后期GRα mRNA優(yōu)先在肺臟和脾臟中表達(dá)，其次是肝臟和腎臟，在腦、卵巢和心臟中的表達(dá)量最低。也有學(xué)者認(rèn)為GR 幾乎在所有細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，但在不同組織或不同細(xì)胞內(nèi)的亞型有差異[10]。在本研究中，熱應(yīng)激第1 d、7 d 和14 d，十二指腸和結(jié)腸中GR 表達(dá)量明顯升高，且在第14 d 達(dá)峰值。推測(cè)隨著熱應(yīng)激的進(jìn)程，腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有益菌數(shù)量下降，而致病菌數(shù)量增多，腸道粘膜的炎癥過(guò)程增強(qiáng)，導(dǎo)致了GR 表達(dá)量上調(diào)。

圖2 受試豬不同腸段中GR 蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression level of GR protein in different intestinal gut of pigs