朱 慧，朱文俠，黃廣智，馬小娜

(1.延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000；2.延安大學附屬醫(yī)院皮膚科，陜西 延安 716000)

臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)生物活性好，次均取材量較大且無倫理限制。mUCMSCs具有自我更新和向骨、軟骨、脂肪、心肌、肌纖維等成熟細胞分化的潛能。除此之外，還具有MSC的以下生物學特性[1]，主要包括：①免疫調節(jié)：有低免疫原性，移植后免疫排斥反應較小。②旁分泌功能[2]：MSCs可產生細胞因子、趨化因子、外泌體等，參與機體免疫調控。③歸巢特性：與趨化因子作用，靶向遷移向損傷組織。因此，UCMSCs現(xiàn)常用作治療疾病、組織工程、再生醫(yī)學等研究的種子細胞。在體內及一些體外實驗中，細胞示蹤是必要的實驗手段。

增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecent protein，eGFP)示蹤法是用慢病毒作為載體將eGFP基因轉染到細胞，表達GFP以顯示綠色熒光，該方法熒光特異性高，易于檢測并且對細胞生物學特性影響較小，是目前較理想的細胞示蹤方法，也可直接利用GFP基因小鼠直接培養(yǎng)原代細胞[3]，用于示蹤實驗，原理一致。本研究擬用慢病毒介導的eGFP標記小鼠臍帶間充質干細胞(mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs)，確定合適的最佳感染復數(MOI)，為其示蹤等實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6雌性小鼠，8周齡，懷孕14～15天，體重30～35 g，由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供【SCXK(滇)2013-0001】，飼養(yǎng)于昆明總醫(yī)院動物實驗中心【SYXK(滇)2014-0010】。DMEM/f12培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Invitrogen，USA)和trypsin-EDTA(Invitrogen，USA)，流式細胞術抗體(ebioscience，USA)；eGFP慢病毒(吉滿生物公司)。相差顯微鏡、熒光顯微鏡(NIKON)；活體成像儀(MIIS，USA)。

1.2 mUCMSCs的分離培養(yǎng)

處死C57BL/6小鼠(孕16～17 d)，取子宮串珠置于無菌50 mL離心管內，迅速帶至超凈工作臺，無菌生理鹽水清洗臍帶3次。剪碎于1.5 mL EP管中，肉眼觀成糊狀，加入含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液(250～500 μL，根據組織勻漿的量自行判斷)，移液槍輕輕吹吸至充分懸浮后，均勻鋪至25 cm2培養(yǎng)瓶瓶底，靜置于37℃、CO2培養(yǎng)箱，16～18 h后輕拿至倒置顯微鏡下觀察細胞生長特性及形態(tài)特征并適當補液。每2～3日用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液換液，注意觀察細胞生長情況，組織塊周圍細胞較為聚集時可進行第一次傳代，傳代時換75 cm2或更大底面積的培養(yǎng)瓶，約3～5 d達80%融合時進行傳代。收集第3代mUCMSCs，用于下一步實驗，若較多則凍存。

1.3 mUCMSCs增殖曲線繪制

消化收集的第3代mUCMSCs，計數后用10%FBS培養(yǎng)液調整細胞濃度為2×104個/mL，取100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔設置3個復孔。第3天和第7天全部細胞換液。接種后24 h開始，每天同一時間點取一組復孔換液后加入200 μL CellTiter 96?Aqueous One Solution Reagent，加液后3 h用酶標儀測吸光度值，連續(xù)測試8 d之內細胞增殖情況。取各時間點吸光度的平均值，以時間為橫坐標、吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.4 mUCMSCs分化潛能檢測

消化收集第三代細胞完成體外誘導實驗。成脂分化：接種細胞(4×104/孔)于12孔板中培養(yǎng)6 h后，更換培養(yǎng)液為成脂誘導分化培養(yǎng)液，3～4 d換液一次，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，4%多聚甲醛固定后加入油紅O染色；成骨分化：按照上述成脂分化培養(yǎng)細胞，成骨誘導分化培養(yǎng)21 d后，固定并加入茜素紅染色；成軟骨分化：收集細胞并調整細胞密度為1.6×107/mL，每孔加5 μL到12孔板的中心，形成一個細胞滴，2 h后再緩慢加入成軟骨誘導分化培養(yǎng)液，2～3 d換液一次，不斷培養(yǎng)細胞會形成一個細胞團漂浮起來，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋作病理切片，脫蠟后加入阿新藍染色。

1.5 mUCMSCs的標記

慢病毒載體介導GFP基因轉染mUCMSCs將第3代mUCSC計數，計算每孔細胞數及不同MOI值(MOI=50、100、150、200)對應的病毒滴度的體積，分別平均滴入六孔板的四個孔，并留僅加培養(yǎng)液的空白對照孔，滴入對應體積的病毒，補足培養(yǎng)液，使每孔總液量體積為2 mL，輕輕上下、左右搖板，混勻即使病毒懸液與細胞充分接觸，4～8 h換液。48 h左右進行熒光顯微鏡下觀察和體外細胞信號強度測定。

2 結果

2.1 mUCMSCs的分離及培養(yǎng)

小鼠臍帶取材后靜置培養(yǎng)24～48 h，即可在倒置顯微鏡下觀察到少許梭形貼壁細胞由組織塊邊緣或以散在的方式長出(見圖1A)，2～3 d可見少數細胞集落形成。經過換液棄除未貼壁的組織，第7～10 d可見細胞快速生長至80%融合狀態(tài)時傳代培養(yǎng)。鏡下可見這些細胞密集排列呈現(xiàn)漩渦狀生長，顯示間充質干細胞的典型特征(見圖1B)，初步判斷這些貼壁生長的成纖維細胞樣細胞就是mUCMSCs。

圖1 mUCMSCs的形態(tài)特征bar=400μm

2.2 mUCMSCs增殖曲線

原代細胞增殖較慢，經過傳代的細胞增殖生長較一致。第三代細胞生長曲線(見圖2)顯示：第1～3天細胞增殖緩慢，第4～6天為對數增殖期，以后進入相對穩(wěn)定狀態(tài)。細胞潛伏期、快速增殖期和平穩(wěn)期體現(xiàn)了經典的細胞周期各個階段，呈S型，符合間充質干細胞的生長特征。

圖2 P3mUCMSCs的生長曲線

2.3 mUCMSC的成軟骨、成脂、成骨三向分化

體外誘導分化實驗顯示：第三代mUCMSCs經成軟骨分化，誘導培養(yǎng)14 d后，固定并行病理切片檢測，可觀察到大量氨基葡聚糖被阿新蘭染成藍色(見圖3A)，即成軟骨分化陽性。同樣，成脂分化誘導培養(yǎng)14 d后，可觀察到大量脂滴的出現(xiàn)，油紅O染色后，可見脂滴被染成紅色(見圖3B)，即成脂分化陽性；成骨分化誘導培養(yǎng)21 d后，可觀察到白色結節(jié)，茜素紅染色后，可見鈣質結節(jié)被染成紅色(見圖3C)，即成骨分化陽性。

圖A，圖B，bar=100μ；圖C，bar=40μm

圖3mUCMSCs的體外誘導分化

2.4 慢病毒載體介導GFP基因轉染mUCMSCs的MOI篩選

將含GFP基因的慢病毒與mUCMSCs共培養(yǎng)48 h后，觀察不同MOI值eGFP慢病毒對mUCMSC的轉染情況。熒光場下可見表達綠色熒光蛋白的細胞，明場下可見所有細胞，疊加后可見表達GFP，也就是被GFP標記的細胞在所有細胞的占比，MOI=150比例最高，達95%以上(見圖4)。小動物活體成像儀下，曝光5分鐘拍照檢測細胞信號強度，MOI值=150的細胞組高于MOI值=50、100、200(見圖5，數值見表1)。

圖4 不同MOI值eGFP慢病毒對mUCMSC的轉染熒光表達對比(A、B：bar=400μm)

圖5 不同MOI值轉染的mUCMSC體外信號強度

MOI50100150200ROI1.367×1081.491×1081.971×1081.373×108

3 討論

臍帶和骨髓來源的間充質干細胞為目前研究較為關注的多能干細胞。骨髓間充質干細胞的生物學特性易受供者年齡及身體狀況甚至取材部位影響[4]，且取材有倫理學限制，而UCMSC由胎兒臍帶分離培養(yǎng)得到，將臍帶變廢為寶，增殖等生物學活性較為穩(wěn)定，且不受倫理學限制[5]。目前MSC治療疾病多處于動物實驗階段，且疾病的標準動物模型多為小鼠，體內實驗為研究的基本步驟，因此mUCMSC的有效標記示蹤顯得尤為重要。

綠色熒光蛋白(Green fluorence protein，GFP)是從水母中獲得的一種發(fā)綠色熒光的蛋白，常用質粒載體轉染、病毒載體轉染和綠色熒光蛋白轉基因動物3種主要的標記細胞方式。本研究成功分離培養(yǎng)出mUCMSC，并根據貼壁生長、形態(tài)特征及生長曲線規(guī)律判斷，用誘導液成功將其向骨骼、脂肪和軟骨三個方向分化，可鑒定其為間充質干細胞特性。利用慢病毒作為載體，將熒光蛋白基因轉染到mUCMSC，使其表達熒光蛋白，這種標記方法可以利用顯影設備追蹤到移植入小鼠體內被標記的細胞，如果被標記細胞增殖分裂，則熒光蛋白將會在子代表達；被標記細胞死亡，則熒光消失，這就使得移植入小鼠體內的MSC的去向、存活、代謝和增殖等情況能很好地被觀察到[6]。eGFP慢病毒攜帶的是表達增強型綠色熒光蛋白的基因，因其穩(wěn)定且毒性小，應用范圍較廣。MOI(multiplicity of infection，復染指數)是一個比值，當MOI=1時，病毒滴度與細胞個數的比例是1：1，即一個滴度的病毒對應一個細胞。病毒滴度指的是1 mL病毒液內的活性病毒數。本實驗中，MOI=150時，細胞的轉染率達95%以上，可不用嘌呤霉素篩選，直接輸入小鼠體內，進行細胞示蹤，為體內示蹤實驗奠定基礎。