劉佳霖，高麗嬌，曹 蘭，羅文華，楊金龍，戴茜茜，程 尚，姬聰慧

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶402460)

蜂王漿是我國重要的天然、綠色保健蜂產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及10-羥基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）等生物活性物質(zhì)[1-3].大量研究表明[3-8]，蜂王漿具有減緩人體衰老、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗菌消炎、調(diào)節(jié)血壓及血糖等多種營養(yǎng)保健及醫(yī)療功能，也可應(yīng)用于食品、醫(yī)療及日化等多個(gè)行業(yè).然而，新鮮蜂王漿僅能在-20℃冷凍條件下長(zhǎng)期儲(chǔ)存，其穩(wěn)定性及水溶性較差，且具有酸澀辛辣的不良口感，極大地降低了蜂王漿的商品價(jià)值，限制了蜂王漿在多領(lǐng)域中的應(yīng)用[9-12].由此，探索改善蜂王漿不良特性的新型技術(shù)，制備易于保存及添加的蜂王漿制品具有重要的意義.

β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin）是由7個(gè)葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵連接而成的桶型低聚糖，具有內(nèi)疏水外親水的空腔結(jié)構(gòu)，能夠通過包合反應(yīng)對(duì)原料小分子物質(zhì)進(jìn)行包埋，改變?cè)显械奈锢砑盎瘜W(xué)特性，形成穩(wěn)定性及水溶性較高的包合物[13-15].基于β-環(huán)糊精制備的包合物并沒有改變?cè)显镜幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)，且包合反應(yīng)條件溫和，對(duì)其營養(yǎng)成分及功能活性影響較小[16，17].目前，環(huán)糊精包合技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及日化等多個(gè)行業(yè)，在提高原料穩(wěn)定性、水溶性及改善不良口感等方面發(fā)揮著重要作用.研究顯示，β-環(huán)糊精包合技術(shù)能夠顯著提高蜂王漿的穩(wěn)定性及水溶性，蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物的水溶性蛋白質(zhì)含量占王漿總蛋白含量的92.06%，顯著高于其他植物蛋白酶酶解產(chǎn)物；此外，酸、堿、熱及72 h常溫處理對(duì)包合物無顯著影響[18].前人的研究已初步證實(shí)了環(huán)糊精包合技術(shù)在提高蜂王漿穩(wěn)定性及水溶性方面的作用，但有關(guān)包合物的營養(yǎng)價(jià)值及功能活性仍未有報(bào)道.

本研究以10-HDA含量、17種氨基酸含量和組成以及抗氧化活性為主要指標(biāo)，分析蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物的主要營養(yǎng)成分及功能活性，明確包合技術(shù)在蜂王漿深加工中的具體作用，為包合技術(shù)在蜂王漿深加工中的實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蜂王漿購自重慶佳聯(lián)生物技術(shù)有限公司；β-環(huán)糊精購自河南金潤食品添加劑有限公司；亞油酸購自 Macklin；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH）購自 Macklin；總抗氧化能力（total antioxidant capability，T-AOC）試劑盒購自南京建成；硫氰酸銨NH4SCN購自Macklin；氯化亞鐵FeCl2（分析純）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；超濾離心管（50 mL 3 ku）購自Millipore.

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津公司）；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀（日本日立高新技術(shù)公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；H4-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；C-MAG HS4磁力攪拌器（IKA）.

1.3 方法

1.3.1 蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物的制備 依據(jù)文獻(xiàn)中β-環(huán)糊精包合蜂王漿的基本工藝[18]并加以調(diào)整，獲得本研究的包合反應(yīng)工藝，即：制備料液比為1∶9的蜂王漿水溶液，調(diào)節(jié)pH＝8.7，準(zhǔn)確加入β-環(huán)糊精至終濃度為12.50 mg·mL-1，在27℃下攪拌反應(yīng)5 h，過濾，所得濾液即為蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物.該包合物的水溶性蛋白提取率為97.28%±0.15%，明顯高于文獻(xiàn)中蜂王漿包合物的水溶性蛋白質(zhì)提取率.

1.3.2 蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物 10-羥基-2-癸烯酸含量的測(cè)定 參照標(biāo)準(zhǔn) GB 9697—2008《蜂王漿》[19]，采用高效液相色譜法測(cè)定蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物的10-HDA含量，并根據(jù)稀釋倍數(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算.

1.3.3 蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物17種氨基酸含量的測(cè)定 參照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》[20]，采用鹽酸水解—氨基酸自動(dòng)分析儀法測(cè)定蜂王漿及其包合物17種氨基酸的含量.分別計(jì)算蜂王漿及其包合物中必需氨基酸含量（essential amino acids，EAA）、非必需氨基酸含量（non-essential amino acids，NEAA）、總氨基酸含量（amount of amino acids，TAA）、必需氨基酸與總氨基酸的比值（EAA／TAA）以及必需氨基酸與非必需氨基酸的比值（EAA／NEAA），并參考FAO／WHO推薦的氨基酸模式譜，對(duì)蜂王漿及其包合物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)[21，22].

1.3.4 蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物的抗氧化活性測(cè)定 將制備的包合物過濾，選擇截留分子量為3 ku的超濾離心管進(jìn)行超濾（5000×g，4℃，60 min），超濾后獲得2種肽段產(chǎn)物，即＞3 ku及0～3 ku肽段產(chǎn)物，并使用容量瓶將兩種肽段產(chǎn)物定容至超濾前包合物的加樣體積.

（1）抑制亞油酸氧化的測(cè)定.參考許建香等[23]的方法，取原王漿溶液、包合物及兩種肽段產(chǎn)物各1 mL，分別加入1 mL濃度為2.51%的亞油酸無水乙醇溶液，再加入2 mL 0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液和1 mL無水乙醇（待測(cè)樣品）或去離子水（空白對(duì)照），封閉后放在暗處保持40℃恒溫.取50 μL上述溶液，加入 4.85 mL 75%的乙醇溶液和 50 μL 30%的 NH4SCN，再加入 50 μL 0.02 mol·L-1溶解于 3.5%鹽酸的FeCl2，準(zhǔn)確反應(yīng)3 min后測(cè)定其在500 nm處的光密度，以后每隔24 h測(cè)定1次.

（2）清除DPPH自由基能力的測(cè)定.參考許建香等[23]的方法，使用無水乙醇溶解DPPH，使其濃度為0.2 mmol·L-1（78 mg·L-1），取原王漿溶液、包合物及兩種肽段產(chǎn)物的稀釋溶液（稀釋10倍）各2 mL，分別加入2 mL 0.2 mmol·L-1的DPPH溶液，混勻，以溶劑為對(duì)照在520 nm處測(cè)定其光密度（D1）；同時(shí)，原王漿溶液、包合物及兩種肽段產(chǎn)物的稀釋溶液各2 mL，分別加入2 mL無水乙醇，充分混勻，測(cè)定其520 nm處的光密度（D2），測(cè)定空白對(duì)照的520 nm處光密度（D3）.抑制率根據(jù)下列公式計(jì)算：

（3）總抗氧化能力測(cè)定.采用T-AOC試劑盒測(cè)定原王漿溶液、包合物及兩種肽段產(chǎn)物的總抗氧化能力，根據(jù)試劑盒說明在樣液中依次加入試劑，放置10 min，分別記錄520 nm光密度（D），根據(jù)下列公式計(jì)算其總抗氧化能力.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007版進(jìn)行數(shù)據(jù)整理.蜂王漿及其包合物的10-HDA含量、17種氨基酸含量及抗氧化活性采用SPSS 16.0獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)或LSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05達(dá)到顯著水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物10-羥基-2-癸烯酸含量

蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物的10-HDA含量與新鮮蜂王漿差異不顯著（P＞0.05），環(huán)糊精包合技術(shù)的反應(yīng)條件對(duì)蜂王漿10-HDA含量無顯著影響（圖1）.

圖1 蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物的10-羥基-2-癸烯酸含量Fig.110-HDA contents in royal jelly and β-cyclodextrin inclusion complex

2.2 蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物的氨基酸含量及營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

蜂王漿及其包合物氨基酸種類齊全，均含有被檢測(cè)的17種氨基酸，其中含量較高的氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸及絲氨酸（表1）.包合物中各氨基酸含量及TAA與新鮮蜂王漿無顯著差異（P＞0.05）；蜂王漿經(jīng)β-環(huán)糊精包合后，其 EAA／TAA 及 EAA／NEAA無明顯變化，并接近或高于FAO／WHO推薦的 0.40 和 0.60[22].

表1 蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物的氨基酸含量1)Table 1 Amino acids contents in royal jelly and β-cyclodextrin inclusion complex

本研究基于FAO／WHO推薦的氨基酸模式譜對(duì)蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)（表2）.蜂王漿及其包合物中各必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無明顯差異，除蛋氨酸＋胱氨酸略低于推薦標(biāo)準(zhǔn)外，兩種樣品的其他各種必需氨基酸比例均高于推薦標(biāo)準(zhǔn).說明，蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物可以作為人體攝取必需氨基酸的重要食源.

2.3 蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物的抗氧化活性

2.3.1 抑制亞油酸氧化的能力 蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物抑制亞油酸氧化的能力如圖2所示，與空白對(duì)照相比，蜂王漿水溶液及包合物＞3 ku肽段產(chǎn)物對(duì)亞油酸的氧化無抑制作用，但包合物及其0～3 ku肽段在0～7 d能夠抑制亞油酸氧化，其中，0～3 ku肽段的抑制效果最好且更持久.由試驗(yàn)數(shù)據(jù)判斷，蜂王漿水溶液及包合物＞3 ku肽段產(chǎn)物對(duì)亞油酸的氧化可能存在促進(jìn)作用.

表2 蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物必需氨基酸組成與FAO／WHO模式比較Table 2 Comparison of amino acid composition among royal jelly， βcyclodextrin inclusion complex， and FAO／WHO recommendation

圖2 添加蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物的亞油酸-NH4SCNFeCl2反應(yīng)體系吸光度隨時(shí)間的變化Fig.2 Changes in absorbance of solution linoleic acid-NH4SCN-FeCl2 added with β-cyclodextrin inclusion complex with time

2.3.2 清除DPPH自由基的能力 如圖3所示，蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物及其0～3 ku肽段產(chǎn)物清除DPPH 自由基的能力顯著低于蜂王漿水溶液（P＜0.05），0～3 ku肽段的抑制率顯著低于包合物（P＜0.05），包合物＞3 ku肽段未檢出具有清除DPPH的能力.

圖3 蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物清除DPPH的能力Fig.3 DPPH radical scavenging activities of β-cyclodextrin inclusion complex and royal jelly

2.3.3 總抗氧化能力測(cè)定 蜂王漿水溶液、包合物、0～3 ku和＞3 ku肽段產(chǎn)物的總抗氧化能力差異顯著（P＜0.05），總抗氧化能力由大到小依次為蜂王漿水溶液、＞3 ku肽段、包合物及0～3 ku肽段（圖4）.

圖4 蜂王漿及其β-環(huán)糊精包合物總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capabilities of β-cyclodextrin inclusion complex and royal jelly

3 討論

β-環(huán)糊精包合技術(shù)是一種應(yīng)用廣泛的蛋白質(zhì)物理改性技術(shù)，能夠顯著提高原料的穩(wěn)定性及水溶性，并更好地保留原料的營養(yǎng)價(jià)值及保健功能[16，17].研究顯示，β-環(huán)糊精包合技術(shù)能夠明顯改善蜂王漿的穩(wěn)定性及水溶性[18]，但包合物的營養(yǎng)價(jià)值及保健功能仍沒有相關(guān)報(bào)道.10-HDA是蜂王漿重要的生物活性物質(zhì)，約占蜂王漿鮮重的2%，具有增強(qiáng)免疫、抗癌、抗菌消炎及抗輻射等多種保健功能，其含量是評(píng)價(jià)蜂王漿質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[24].本研究顯示，蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物10-HDA含量與新鮮蜂王漿無顯著差異，包合技術(shù)的反應(yīng)條件對(duì)蜂王漿的10-HDA影響較小.

蛋白質(zhì)是蜂王漿最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，約占蜂王漿干重的36.0%～55.0%，蜂王漿中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值是決定蜂王漿品質(zhì)的重要因素[9，21，25].現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)普遍認(rèn)為，食物中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值與其氨基酸組成密切相關(guān)，其必需氨基酸的含量及組成是影響食物蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的關(guān)鍵因素[26].本研究顯示，蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物17種氨基酸含量及必需氨基酸組成與新鮮蜂王漿無顯著差異；與FAO／WHO推薦的氨基酸模式譜比較表明，除蛋氨酸與胱氨酸低于推薦標(biāo)準(zhǔn)外，蜂王漿及其包合物的其他必需氨基酸比例均優(yōu)于推薦標(biāo)準(zhǔn).因此，食用蜂王漿及其包合物可為人體提供豐富且均衡的必需氨基酸，β-環(huán)糊精包合技術(shù)對(duì)蜂王漿的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值無顯著影響.

機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生和積累的自由基對(duì)DNA、多糖、蛋白質(zhì)、酶及脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)的氧化損傷是導(dǎo)致衰老和多種病變的主要因素[27，28].亞油酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸，是人體生長(zhǎng)發(fā)育的必需脂肪酸，極易在自由基的作用下發(fā)生氧化，其產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化及癌癥的發(fā)生具有促進(jìn)作用[28].本研究顯示，蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物抑制亞油酸氧化的能力顯著高于新鮮蜂王漿，其中包合物0～3 ku的肽類物質(zhì)抑制能力最強(qiáng)且更持久.由此表明，β-環(huán)糊精包合技術(shù)可用于制備具有較高抑制亞油酸氧化活性的蜂王漿制品.在抑制亞油酸氧化的試驗(yàn)中，蜂王漿水溶液及包合物＞3 ku的肽類物質(zhì)對(duì)亞油酸的氧化可能存在促進(jìn)作用，原因可能是兩種溶液中的大分子蛋白質(zhì)在乙醇溶液中變性沉淀，進(jìn)而引起500 nm處吸光度的增高，樣液并未促進(jìn)亞油酸氧化，該結(jié)果與許建香等[23]研究一致.在本研究中，包合物及其＞3 ku、0～3 ku的肽類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力及總抗氧化能力顯著低于新鮮蜂王漿.造成該結(jié)果的原因可能與包合物發(fā)揮緩釋性能的原理有關(guān)，β-環(huán)糊精在包合蜂王漿的過程中，活性蛋白或酶的功能基團(tuán)包埋在環(huán)糊精的桶型結(jié)構(gòu)內(nèi)，導(dǎo)致其抗氧化活性不能快速表現(xiàn)，使包合物的抗氧化活性顯著降低，但包合物的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于蜂王漿，其緩釋性能可延長(zhǎng)包合物的抗氧化活性.在本研究中，蜂王漿-β-環(huán)糊精包合物在40℃條件下仍能長(zhǎng)時(shí)間維持抑制亞油酸氧化的能力，也證實(shí)了包合物具有更高的穩(wěn)定性及更加持久的抗氧化活性.這也與高瑞英等[29]研究結(jié)果一致，阿魏酸-α-環(huán)糊精包合物清除自由基的能力弱于阿魏酸，但包合物的抗氧化作用更加持久.

綜上所述，β-環(huán)糊精包合技術(shù)可以顯著提高蜂王漿抑制亞油酸氧化的能力，其包合物10-HDA含量及蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值與新鮮蜂王漿基本一致，包合物清除DPPH自由基及總抗氧化能力有所減弱，但抗氧化作用更持久.結(jié)合包合物較高的穩(wěn)定性及水溶性，本研究認(rèn)為，基于環(huán)糊精包合技術(shù)制備水溶性蜂王漿在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景.