李金婷，張佐然，梁雅靜，孔維文，李云龍，何曉青

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；2.北京市植物保護站，北京100029)

黃瓜白粉病俗稱“白毛病”[1]，葉片為主要的發(fā)病部位，發(fā)病時葉片呈現(xiàn)大片白粉區(qū)，后期逐漸變黃變脆.其病原菌為單囊殼白粉病菌（Podosphaera xanthii），喜于適宜的溫度及高濕度環(huán)境下生長，因此，黃瓜白粉病常見于大棚及溫室環(huán)境中，北方尤為常見[2].感染黃瓜白粉病的葉片較脆弱，光合作用下降，嚴重時會導(dǎo)致植株枯死，對黃瓜產(chǎn)量有巨大的影響.該病的特點是傳播速度快、受災(zāi)區(qū)域廣，給全國黃瓜種植業(yè)帶來了很大的安全隱患[3].國內(nèi)外對于黃瓜白粉菌的研究多集中在其形態(tài)鑒定和化學(xué)防治方面[4-5]，較少涉及分子方面的檢測.因此，建立一種高度敏感、可定量檢測病原體的方法，對黃瓜白粉病的控制十分重要.

疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）是一類在強光照射下與核酸高度親和的染料.PMA染料可以穿過死細胞不完整的細胞膜與DNA共價連接阻止死細胞DNA的擴增[6-7]，從而達到檢測活性細胞的目的.實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一種基于聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的生物學(xué)技術(shù).在PCR過程中可添加與雙鏈DNA結(jié)合的非特異性染料或特異性探針，對目標DNA擴增過程進行實時監(jiān)測，通過將PCR產(chǎn)物連接到載體上建立已知拷貝數(shù)的標準曲線，進而計算目標DNA的起始量.因此，qPCR經(jīng)常被用于目標物質(zhì)的定量檢測.研究發(fā)現(xiàn)，細胞在死亡時仍能保持DNA活性不受影響，而傳統(tǒng)的qPCR只可以定量到病原體總數(shù)，無法區(qū)分病原體是否有活性[8-9].PMA-qPCR技術(shù)能夠判斷細胞膜是否完整，根據(jù)其完整性辨別活菌和死菌.其原理是當(dāng)細胞膜受損時，細胞DNA能夠與進入細胞膜的PMA相結(jié)合，從而阻止DNA的復(fù)制，qPCR擴增也因此被阻斷.當(dāng)強光照射時，DNA與PMA的結(jié)合因形成疊氮集團而變得更加緊密，并且強光能消除未與PMA成功結(jié)合的DNA[10].

目前，PMA-qPCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物、食品等的研究：針對黃瓜、番茄等植物的病原菌（如青枯病菌、番茄病潰瘍病菌、細菌性斑點病菌等）已建立了具體的檢測方法[11-14]；同時，利用此方法可對乳制品、肉類等的活菌數(shù)進行定量檢測[15].但尚未見該方法用于瓜類白粉病菌的研究.本研究擬通過PMA-qPCR方法鑒定黃瓜白粉病病原菌，并檢測患病葉片中的活性致病菌和臭氧處理后的活菌比例，以期為黃瓜白粉病的預(yù)防與控制提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 患白粉病黃瓜葉片采自北京市房山區(qū)；黃瓜細菌性角斑病致病菌（Pseudomonas syringaepv.lachrymans）、黃瓜細菌性緣葉枯病菌（Pseudomonas marginalis和P.viridiflava）均由北京植物保護站提供；大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）購自國家微生物菌種保藏中心.

1.1.2 主要儀器及試劑 2×Super HiFi PCR Mix、高純質(zhì)粒大提試劑盒、pGM-Simple-T Fast連接試劑盒、細菌基因組提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TRIZOL試劑和Super-Real PreMix Plus均購自天根生化科技（北京）有限公司；電泳儀和凝膠成像儀購自美國伯樂公司；MX3005P qPCR儀購自美國愛捷倫科技公司；50×TAE Buffer、Goldview購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司；100 bp PlusⅡDNA Ladder購自全式金（TransGen）公司；Qubit核酸／蛋白定量儀購自美國英杰生命有限公司；H2O3程控金屬浴購自金銀杏生物科技（北京）有限公司.PMA染料購自美國Biotium公司；其他常規(guī)試劑、耗材購自北京易秀博谷生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 患病葉片表面黃瓜白粉菌ITS序列擴增 用Primer Premier 5軟件根據(jù)GenBank上黃瓜白粉菌（AB026144）的 rDNA-ITS保守區(qū)設(shè)計引物 PxA-f、PxA-r，序列見表1.輕輕刮取患黃瓜白粉病的葉片表層得到病菌孢子及菌絲，提取基因組，以得到的基因組為模板進行PCR擴增.PCR反應(yīng)體系：模板2 μL，2×Super HiFi PCR Mix 25 μL，上、下游引物各 1 μL，補足 ddH2O 至 50 μL.反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，共35 個循環(huán)；68 ℃ 5 min.回收、保存擴增得到的PCR產(chǎn)物并進行測序（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司）.

1.2.2 qPCR特異性引物設(shè)計和驗證 根據(jù)引物PxA-f、PxA-r獲得的序列，利用Primer Premier 5設(shè)計引物，得到一對擴增長度為93 bp的引物PxB-f、PxB-r，序列見表1.為驗證引物特異性，以黃瓜白粉病致病菌基因組為模板，常見的黃瓜致病菌（黃瓜細菌性角斑病致病菌、黃瓜細菌性緣葉枯病菌）以及模式菌株大腸桿菌和金黃色葡萄球菌基因組為對照進行qPCR檢測.qPCR體系：SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，上、下游引物各 0.4 μL，模板 2 μL，加水補足至 25 μL.擴增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共40個循環(huán).

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 qPCR標準品的構(gòu)建 將引物PxA-f、PxA-r擴增得到的片段與pGM-Simple-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB抗性平板上，挑取白色菌落接種于氨芐青霉素終濃度為80 μg·mL-1的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行測序鑒定，將其作為qPCR的標準品.

1.2.4 qPCR標準曲線的建立 用Qubit核酸定量儀測定質(zhì)粒濃度，將其換算得到質(zhì)粒拷貝數(shù).換算公式為N＝NA×c/l×660，其中，N為質(zhì)?？截悢?shù)，NA為阿伏伽德羅常數(shù)6.02×1023，c為質(zhì)粒濃度，l為質(zhì)粒長度，660為一個堿基的相對分子質(zhì)量[14].在確定拷貝數(shù)之后，將質(zhì)粒按5×10～5×106個·μL-1稀釋為6個梯度，在MX3005P qPCR儀上進行PCR擴增和熒光定量檢測.反應(yīng)體系參考1.2.2，反應(yīng)結(jié)束后獲得標準曲線和熔解曲線.

1.2.5 黃瓜葉片白粉病致病菌檢測 （1）PMA預(yù)處理和DNA提取.按照李聰聰?shù)萚10]的方法制備PMA工作液：取8 mg PMA染料溶解于20%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成1 μg·μL-1儲備液，-20℃保存.取患病葉片不同部位（全組織、表面、內(nèi)部）經(jīng)臭氧處理不同時間（0、20、30、40、50 min），液氮研磨后分別稱取兩管100 mg的粉末，一管直接提取基因組（總菌數(shù)），另一管經(jīng)PMA處理后再提取基因組（活菌數(shù)）.向管內(nèi)加入1 mL PBS，震蕩15 s以上用鋁箔紙包裹EP管管蓋以下的部分以避光，再向管中加入20 μL PMA工作液，使其終濃度為20 μg·mL-1.隨后將離心管置于轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的恒溫搖床中5 min，然后將離心管置于低溫條件下，使用氯素?zé)魧ζ湔丈?0 min，照射期間每隔20 s轉(zhuǎn)動一次離心管，以達到均勻照射的目的[16].最后將離心管放入低溫離心機中（轉(zhuǎn)速為10000 r·min-1）離心10 min，離心結(jié)束后去除上清液，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取DNA.

提取基因組后用Nanodrop測每管基因組的D260nm值，將同一臭氧處理時間的PMA處理組和對照組的基因組濃度調(diào)至相同（基因組提取時不同個體會有誤差，且提取到的植物基因組相對于病原基因組可忽略不計，所以最大限度降低兩管的誤差，可以提高活菌含量計算的準確性）.

（2）樣品DNA的qPCR檢測.以不同處理DNA為模板，使用MX3005P qPCR儀進行qPCR檢測，每個處理設(shè)3次平行試驗.反應(yīng)體系參照1.2.2，將測得的循環(huán)數(shù)（Ct值）代入標準曲線獲得黃瓜白粉菌的拷貝數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜白粉菌ITS序列擴增結(jié)果

ITS序列擴增結(jié)果顯示產(chǎn)物長度為432 bp.通過GenBank比對發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物序列與單囊殼白粉病菌的同源性為100%，說明待檢測黃瓜葉片表面的病菌為單囊殼白粉病菌.

2.2 qPCR標準曲線的建立

用插入質(zhì)粒的PxA-f、PxA-r引物擴增ITS序列，與預(yù)期片段序列進行比對，可知兩段序列具有100%的同源性.6個梯度的稀釋標準品經(jīng)qPCR擴增后自動生成熔解曲線、閾值和基線.以質(zhì)粒起始模板拷貝數(shù)為橫坐標（X），不同拷貝數(shù)對應(yīng)的Ct值為縱坐標（Y），繪制黃瓜白粉菌基因檢測的標準曲線，得出模板數(shù)量與 Ct值之間的線性關(guān)系：Y＝-3.294×logX＋38.04，相關(guān)系數(shù)（R2）為 0.994，擴增效率（Eff.）為 101.2%（圖1）.通過此公式可計算待測樣本的初始拷貝數(shù).另外，熔解曲線具有單一峰值（圖2），DNA熔解溫度（Tm值）為81.0℃，無引物二聚體和非特異擴增的出現(xiàn)，證明引物特異性良好.

圖1 黃瓜白粉菌基因的標準曲線Fig.1 Standard curve of cucumber powdery mildew pathogen gene

圖2 黃瓜白粉菌基因的熔解曲線Fig.2 Dissociation curve of cucumber powdery mildew pathogen gene

2.3 qPCR特異性檢驗

通過qPCR對不同的黃瓜病原菌和2種模式細菌進行定量.結(jié)果顯示，僅黃瓜白粉病致病菌有擴增，Ct值為18.42；其余黃瓜病原菌以及大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無Ct，證明PxB引物可以區(qū)分白粉菌和其他黃瓜病原菌，能夠用于后續(xù)PMA-qPCR方法的建立.

2.4 qPCR重復(fù)性檢驗

選擇5×102、5×104、5×1063個梯度的質(zhì)粒進行組間和組內(nèi)的重復(fù)試驗，以確定qPCR過程中標準曲線的準確性.結(jié)果（表 2）顯示，組內(nèi)變異系數(shù)為 0.17%～0.90%，組間變異系數(shù)為 0.45%～1.05%，表明 qPCR的重復(fù)性良好，可用于后續(xù)試驗.

表2 標準質(zhì)粒的組內(nèi)和組間變異系數(shù)Table 2 Variation coefficient of intra-assay and inter-assay for standard plasmid

2.5 不同處理的拷貝數(shù)差異

qPCR測得，經(jīng)PMA預(yù)處理的樣品（臭氧處理30 min的葉片全組織）Ct值為28.74，對照組Ct值為14.74（圖3）；將 Ct值代入標準曲線得到兩者的拷貝數(shù)分別為4.335×102和9.448×106個·μL-1.

圖3 不同處理樣品擴增結(jié)果和質(zhì)粒的標準擴增曲線Fig.3 Amplification results and standard curves of plasmid under different treatments

2.6 PMA-qPCR檢驗臭氧處理后的活菌比例

臭氧處理后，黃瓜葉片全組織、葉片表面、葉片內(nèi)部病原菌活菌比例隨著處理時間的延長均呈減少趨勢.但葉片全組織活菌比例在20～40 min下降幅度不顯著，50 min時活菌比例為17.1%；葉片表面在50 min時活菌比例為15.6%；葉片內(nèi)部活菌的減少趨勢不如葉片表面明顯，20～40 min活菌比例為52.6%～56.8%，50 min時活菌比例為38.6%（表3）.本研究中，在不同臭氧處理時間下，經(jīng)PMA處理后的樣品相對于未經(jīng)PMA處理的樣品，檢測到的活菌比例均有明顯下降，說明該方法可以用于黃瓜白粉病活菌的檢測.

表3 不同處理部位在各臭氧處理時間點的總菌數(shù)、活菌數(shù)及其比例Table 3 Total bacterial count，viable count and percentage of different parts of leaves sterilized for different durations

3 討論

qPCR技術(shù)作為一種快速高效的診斷方法，目前已經(jīng)廣泛用于各種病原菌的檢測，qPCR的主要方法包括SYBR GreenⅠ熒光染料法和Taqman探針法[17].前者能與所有雙鏈DNA的小溝結(jié)合激發(fā)出綠色熒光，對DNA模板不具有選擇性，對引物的特異性要求高，需要防止非特異性擴增等現(xiàn)象的發(fā)生；后者主要是利用Taq酶的5′核酸外切酶活性，探針只與模板結(jié)合，因而具有選擇性，但其合成探針的費用較高，且操作較為復(fù)雜.本研究根據(jù)黃瓜白粉病病原菌設(shè)計的引物熔解曲線Tm值單一，無引物二聚體，特異性強，因此采用了SYBR GreenⅠ熒光染料染色的方法.

張曉云等[18]利用病斑面積的大小研究了枯草芽孢桿菌CAB-1抑菌蛋白對黃瓜白粉病的防治作用，范瑛閣等[19]采用掃描電鏡研究了3株生防細菌對黃瓜白粉菌的拮抗、溶菌和重寄生作用，但這兩種研究方法都無法準確檢測處理后的黃瓜白粉菌活菌數(shù)量.本研究通過設(shè)計黃瓜白粉菌特異性引物，建立了PMA-qPCR方法，檢測了黃瓜白粉菌的活性病原菌和臭氧處理后的黃瓜白粉菌活菌比例.臭氧處理50 min時檢測到的活菌比例較處理前有明顯下降，說明該方法可以有效區(qū)分出黃瓜白粉菌中的活性菌.

PMA-qPCR中的PMA染料可以穿過死細胞不完整的細胞膜與DNA共價結(jié)合，彌補了qPCR方法不能檢測樣品中活細胞比例的不足.通過PMA-qPCR方法可從分子水平對黃瓜白粉病菌進行檢測，也可用于檢測黃瓜白粉病的生物防治效果，有助于制定高效的防治策略，并且具有低成本、精確、快捷、實用性強等優(yōu)點.