鄒 蓉(綜述) 袁源智(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科 上海 200032)

血管新生相關(guān)的疾病(如眼疾、癌癥等)嚴(yán)重威脅著人類健康。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)等眼部視網(wǎng)膜血管新生引起的視力下降甚至喪失,是發(fā)達國家中青年勞動力致盲的主要原因[1]。目前臨床上已經(jīng)將血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)途徑的靶向藥物(如貝伐單抗、雷珠單抗、康柏西普等)用于抗血管新生治療,但是長期眼部抑制VEGF或會引起神經(jīng)元毒性和一些眼部并發(fā)癥[2-3],為進一步了解血管新生的生理學(xué)和病理學(xué)機制,并尋找更有效的治療靶點,本文對最近發(fā)現(xiàn)的糖酵解過程中生理性和病理性血管新生作用進行總結(jié),首先介紹糖酵解的重要調(diào)節(jié)劑6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)在不同情況下的表達水平的改變及其調(diào)節(jié)機制,然后介紹PFKFB3調(diào)節(jié)的糖酵解過程對內(nèi)皮細胞功能的影響,并由此討論其對血管新生過程的影響。

PFKFB3在缺氧條件下的表達缺氧是多種疾病共有的病理生理特點,尤其是病理性血管新生性疾病[4-5]。在缺氧期間細胞代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕刻墙徒獯x來以滿足其能量需求。這種代謝途徑的轉(zhuǎn)變是否在血管新生過程中具有某種作用,尚不清楚。PFKFB3也是糖酵解通量的重要控制因素。PFKFB3基因位于染色體10p15-p14[6],基因中至少含有19個外顯子,并且由于COOH-末端的可變區(qū)可以進行可變剪接,所以目前在人中至少發(fā)現(xiàn)了6種分別具有不同組織選擇性的結(jié)構(gòu)同種型——UBI2K1～6[7]。該基因編碼的蛋白質(zhì)PFKFB3,屬于雙功能酶家族(PFKFB1-4),該家族蛋白在氨基末端含有激酶結(jié)構(gòu)域6-磷酸果糖-2-激酶(6-phosphofructo-2-kinase,PFK-2)以及在羧基末端含有雙磷酸酶結(jié)構(gòu)域果糖-2,6-二磷酸酶(fructose-2,6-bisphosphatase 2,FBPase-2),并通過PFK-2催化2,6-二磷酸果糖的合成;通過FBPase-2催化其分解,當(dāng)兩者平衡調(diào)節(jié)時,2,6-二磷酸果糖(fructose 2,6-diphosphate,F2,6BP)在體內(nèi)的濃度達到穩(wěn)態(tài)[8]。在體內(nèi)F2,6BP不僅是糖酵解關(guān)鍵酶PFK-1的變構(gòu)激活劑,也是果糖1,6-二磷酸酶(FBPase-1)的抑制劑[9-10](圖1)。由于PFKFB3缺乏像PFKFB1的Ser32磷酸化位點[11],無法通過該位點的磷酸化下調(diào)激酶活性,所以PFKFB3的激酶/磷酸酶活性的比例比其他家族成員高[12]。已知在PFKFB3基因的增強子區(qū)域中含有2個拷貝的缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)結(jié)合基序(5’-ACGTG-3’)[13],在缺氧條件下通過HIF-1α介導(dǎo)PFKFB3表達上調(diào)[14]。

There are two different domains at the amino terminus and the carboxy terminus,which is the structural feature of the bifunctional enzyme.The amino-terminal kinase domain PFK-2 is capable to catalyze the synthesis of F2,6BP,while the carboxy-terminal diphosphatase domain FBPase-2 is responsible for catalyzing the decomposition of F2,6BP,which is the functional feature of the bifunctional enzyme.F2,6BP:Fructose 2,6-diphosphate.
圖1 雙功能酶的結(jié)構(gòu)和功能
Fig 1 Structure and functions of the bifunctional enzyme

PFKFB3的其他調(diào)節(jié)機制研究發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細胞具有高糖酵解代謝,并且當(dāng)腫瘤組織的血管內(nèi)皮細胞中PFKFB3等位基因中的一個拷貝失活,或者在阻斷PFKFB3的作用時,可以通過使腫瘤組織的血管正?；瘉頊p少癌細胞的侵襲,血管內(nèi)滲和轉(zhuǎn)移[15]。PFKFB3在人類多種腫瘤組織和細胞中的表達水平都較正常組織和細胞要高,并且與HIF-1α水平有關(guān)[16-17]。PFKFB3分子中含有多個絲氨酸磷酸化位點,包括s461、s467和s478等。當(dāng)細胞處于缺氧、高滲透壓等應(yīng)激狀態(tài)時,可以通過激活p38/MK2、MAPK、ERK/RSK等激酶的作用,對PFKFB3進行磷酸化,從而增強PFKFB3激酶活性,提高糖酵解通量以適應(yīng)細胞增殖的能量需求[18-20]。在其mRNA的3’非編碼區(qū)中,存在多個拷貝的AUUUA序列,使得mRNA不穩(wěn)定,可以被多種調(diào)節(jié)因素改變蛋白的表達水平[21]。miR-206和miR-26a、miR-26b、miR-449c等微小核苷酸還可以通過直接與該3’-UTR相互作用抑制PFKFB3的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[22-24]。轉(zhuǎn)化生長因子1β(transforming growth factor beta 1,TGF-1β)、雌二醇和胰島素等通過受體介導(dǎo)的信號通路促進PFKFB3的轉(zhuǎn)錄活性,提高蛋白表達水平[19,25-26](圖2)。

In the nucleus,estradiol regulates PFKFB3 gene transcription via ER,high osmotic pressure through the P38/MK2/SRF pathway and hypoxia through the MAPK/HIF-1 pathway.MiR-26a,miR-26b,miR-206,miR-449c affect the translation by direct interaction with PFKFB3 mRNA.Kinases MK2 and MAPK can also play a role in affecting the phosphorylation of PFKFB3 protein;APC/C-Cdk-1 exerts its function by directly degrading PFKFB3.When these factors affect the synthesis or function of PFKFB3 protein,it will have an effect on the glycolysis process.
圖2 PFKFB3的調(diào)節(jié)機制和功能
Fig 2 Function and mechanism of PFKFB3

PFKFB3的生物學(xué)功能PFKFB3表達增高促進糖酵解通量增加,乳酸增多,高水平乳酸可刺激血管新生。PFKFB3還可定位到核內(nèi),通過細胞周期蛋白依賴性激酶,如細胞周期蛋白依賴激酶1(cyclin dependent kinase 1,Cdk-1),促進細胞周期進程,從而促進細胞增殖[27]。泛素蛋白酶體途徑是目前已知的、所有真核生物體內(nèi)具有的高度選擇性的、重要的蛋白質(zhì)降解途徑,泛素連接酶APC/C-Cdk-1可以通過促進PFKFB3泛素化降解,降低細胞的糖酵解,減少進入S期的細胞,抑制細胞增殖[28]。此外,APC/C-Cdk-1通過降解PFKFB3抑制糖酵解途徑,促進磷酸戊糖途徑,細胞中還原型谷胱甘肽合成增多,細胞抗氧化能力增強[28](圖2)。

內(nèi)皮細胞的糖酵解與血管新生

糖酵解參與調(diào)節(jié)血管新生 最近有研究證明人臍靜脈內(nèi)皮細胞中約80%的ATP是通過糖酵解途徑產(chǎn)生的,即使在正常氧分壓下,血管內(nèi)皮細胞也主要利用葡萄糖進行糖酵解產(chǎn)能[29-30]。雖然血管內(nèi)皮細胞與循環(huán)系統(tǒng)中的氧氣有密切的接觸,但是由于細胞內(nèi)線粒體數(shù)量少、體積小,并且為了能將更多的氧氣供給遠處的組織、細胞,所以內(nèi)皮細胞的代謝主要是糖酵解。在成年人中血管是相對靜止的,很少形成新的分支;但是血管內(nèi)皮細胞卻保持很高的可塑性,可以敏銳感知微環(huán)境中的血管生成信號,如VEGF、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGR)等信號分子,并對其做出反應(yīng)。這種改變不僅僅包括分子方面的改變,細胞對能量的需求也在短時間內(nèi)發(fā)生了很大變化[31]。人臍靜脈內(nèi)皮細胞在缺氧時,己糖激酶活性和膜葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1表達被提高,促進了18F-氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)攝取和乳酸的產(chǎn)生[32]。這表明內(nèi)皮細胞的糖酵解代謝過程可能在血管新生中發(fā)揮重要作用。

PFKFB3通過影響發(fā)芽過程影響血管新生 近期有報道發(fā)現(xiàn)細胞糖酵解過程及其調(diào)節(jié)劑PFKFB3在血管新生過程尤其是發(fā)芽過程中具有重要作用[29]。原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外實驗和小鼠的體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),PFKFB3在體外可以刺激內(nèi)皮細胞增殖,PFKFB3基因缺陷小鼠體內(nèi)的血管存在缺陷;進一步研究發(fā)現(xiàn),PFKFB3主要調(diào)節(jié)血管發(fā)芽過程,即主要對Notch-DLL4信號通路介導(dǎo)的尖端細胞和莖細胞的行為進行調(diào)控。內(nèi)皮細胞中的PFKFB3基因沉默時,細胞形成較小且不規(guī)則的片狀偽足,絲狀偽足更少、更短,尖端細胞運動能力受限,無法引導(dǎo)血管發(fā)芽。該研究者還發(fā)現(xiàn),發(fā)芽誘導(dǎo)信號VEGF,成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)等增加PFKFB3表達和糖酵解,而發(fā)芽限制信號DLL4(激活Notch)引起相反的效應(yīng);但是,PFKFB3蛋白表達改變時卻并沒有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞中這些分子的表達[29](圖3)。這可能是因為PFKFB3引起的糖酵解增加主要是為尖端細胞和莖細胞遷移時肌動蛋白的活動提供ATP[33]。因此,內(nèi)皮細胞的代謝調(diào)節(jié)可以作為獨立于血管新生分子調(diào)節(jié)機制之外的另一個抗血管新生治療的靶點[34]。

The VEGF pathway and the FGF2 pathway can promote the expression ofPFKFB3 gene,while the DLL4 signal can inhibit the expression ofPFKFB3 gene,thereby affecting the level of glycolysis in endothelial cells.
圖3 血管新生相關(guān)通路對PFKFB3的調(diào)節(jié)
Fig 3 Regulation of PFKFB3 by angiogenesis-related pathways

PFKFB3抑制劑對生理性和病理性血管新生具有抑制作用 最近研究表明,次優(yōu)劑量的PFKFB3拮抗劑,即小分子3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮(3PO)和VEGFR抑制劑SU5416單獨作用于斑馬魚胚胎時,對椎血管發(fā)育的損傷很小,但是二者聯(lián)合使用時對胚胎中椎血管的損傷加重,高劑量SU5416聯(lián)合3PO時可以廢除幾乎所有胚胎中椎血管的發(fā)育[35]。在激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的小鼠模型中,3PO可以劑量依賴性地降低CNV損傷體積,并且增加VEGFR2單克隆抗體DC101的抗血管生成活性,當(dāng)使用次優(yōu)劑量的DC101時,CNV面積減少38%,而DC101與3PO的組合導(dǎo)致CNV面積減少67%[35]。與CNV一樣,早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的氧誘導(dǎo)小鼠模型主要病變也是病理性血管新生。 在出生后12天(post-natal 12 day,P12)至17天(post-natal 17 day,P17)的血管增殖期間用3PO處理幼崽,P17血管簇形成減少[35]。已知內(nèi)源性雌激素17β-雌二醇(E2)也是促進血管生成的關(guān)鍵因子[36-37]。雌激素通過選擇性G蛋白偶聯(lián)雌激素受體介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移,該過程必需有PFKFB3參與,這為雌激素受體誘導(dǎo)的病理性血管新生的治療提供了更多的思路[38]。

結(jié)語細胞代謝產(chǎn)生ATP以及其他中間產(chǎn)物是維持細胞生存和活動的重要過程?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮糖酵解過程在病理性血管新生中有重要作用,主要是通過調(diào)節(jié)尖端細胞偽足形成和遷移能力促進血管發(fā)芽。通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮異常糖酵解過程抑制異常血管新生,可能是治療眼部或者其他部位病理性血管新生的新方法。