胡安邦 李衛(wèi)青 洪國(guó)岱 蘇 琳 鄒純樸 陳 曉 焦肖寧 朱楊壯壯 胥孜杭

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院-深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院呼吸病科 深圳 518001; 2深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科,3腫瘤科 深圳 518001; 4上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院內(nèi)經(jīng)教研室 上海 201203)

近年的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,無論是在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)達(dá)地區(qū),肺癌已成為發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1-2],其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見的類型,約占80%～85%[3]。肺癌起病隱匿,難以早期診斷,往往確診時(shí)已處于晚期,5年生存率極低。除了常規(guī)的手術(shù)、放療、化療以外,分子靶向治療越來越受到關(guān)注。

Ⅳ型膠原蛋白α3(collagen type Ⅳ alpha 3,COL4A3)屬于Ⅳ型膠原蛋白家族,該基因與腎臟疾病和多種腫瘤密切相關(guān)。COL4A3基因位于人染色體2q36-q37上,含有52個(gè)外顯子,編碼產(chǎn)物為8 114 bp的mRNA和162 000的蛋白質(zhì)[4]。COL4A3的分布僅限于具有組織特異性的基底膜,如腎小球基底膜、耳蝸基底膜、前晶狀體囊的眼基底膜、Descemet膜、卵巢和睪丸基底膜,以及肺泡毛細(xì)血管基底膜[5]。2000年,人類COL4A3的NC1結(jié)構(gòu)域被制成重組蛋白,命名為“tumstatin”,可抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管形成,并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特異性凋亡[6],還可抑制小鼠異種移植模型中人腎細(xì)胞癌和前列腺癌的生長(zhǎng)[7]。Ⅳ型膠原蛋白具有細(xì)胞黏附功能,參與乳腺癌[8]、胃癌[9]、肺癌[10]、急性骨髓性白血病、胰腺導(dǎo)管腺癌、卵巢癌[11]、肝癌[12]、膀胱癌[13]等多種不同腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。在腎臟腫瘤中,COL4A3基因持續(xù)高表達(dá)可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞參與腫瘤基質(zhì)重塑,加速腫瘤發(fā)展進(jìn)程。在分化良好的肺腫瘤中,其腫瘤簇周圍也可檢測(cè)到COL4A3高表達(dá)[14]。本研究旨在探討血清COL4A3蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理及預(yù)后的相關(guān)性,其對(duì)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用,可否作為NSCLC患者預(yù)后不良的獨(dú)立標(biāo)志物,以期為肺癌精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

資料和方法

研究對(duì)象收集2005年至2017年就診于深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院和羅湖區(qū)中醫(yī)院的NSCLC患者,共計(jì)90例,其中男性60例,女性30例,年齡31～86歲,平均55歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network,NCCN) NSCLC治療指南(2017年第2版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn),以及腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期;(2)至少有1個(gè)明確可測(cè)量的病灶(10 mm);(3) Karnofsky (KPS)≥60分,預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月;(4)受試者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的肺癌患者;妊娠期或哺乳期患者;合并有心血管、腎和造血、免疫系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病、精神病等影響療效與安全性判斷的患者;失訪病例。另?yè)?8名健康人作為對(duì)照組。

標(biāo)本采集與檢測(cè)采集患者空腹晨血3 mL,離心后使用COL4A3 ELISA試劑盒(美國(guó)Aviva Systems Biology公司),參照說明書進(jìn)行檢測(cè)。

細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),采用DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),含有100 U/mL青霉素-鏈霉素(美國(guó)Hyclone公司)和10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),在37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖將A549細(xì)胞消化后以3 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板。貼壁過夜后吸去原有培養(yǎng)液,加入含不同濃度COL4A3 (5和10 μg/mL)的完全培養(yǎng)液。分別在干預(yù)1、3、5、7天后加入MTT試劑。置于37 ℃孵育4 h,棄去上清,每孔加入150 μL二甲亞砜(DMSO)溶解甲瓚顆粒,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(D)。

Transwell實(shí)驗(yàn)使用8 μm Transwell過濾器(美國(guó)BD公司)測(cè)定纖維蛋白原(美國(guó)Sigma公司)對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。將含/不含Matrigel(美國(guó)BD公司)涂布的膜放置于上室,然后將0.5 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中的A549細(xì)胞(3×104)加入其中。對(duì)處理組COL4A3(5和10 μg/mL)進(jìn)行相同操作。下室填充500 μL含有10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后,遷移至下部隔室的細(xì)胞用甲醇固定,并用結(jié)晶紫染色。在每孔隨機(jī)選擇的區(qū)域內(nèi)以100×放大率進(jìn)行成像和細(xì)胞計(jì)數(shù)。

克隆形成實(shí)驗(yàn)A549細(xì)胞消化后以500個(gè)/孔接種于6孔板。貼壁過夜后吸去培養(yǎng)液,加入含不同濃度COL4A3(5和10 μg/mL)的完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)7天后,使用4%多聚甲醛室溫固定30 min,加入結(jié)晶紫染料染色20 min。清洗后于倒置顯微鏡下觀察克隆形成數(shù)目,并拍攝顯微成像圖像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),Mann-Whitney U檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析血清COL4A3水平與患者臨床病理特征的關(guān)系,Kaplan-Meier分析血清COL4A3水平與患者生存期的關(guān)系,ROC曲線分析血清COL4A3水平預(yù)測(cè)NSCLC患者腫瘤轉(zhuǎn)移的敏感性與特異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

血清COL4A3水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系90名NSCLC患者的血清COL4A3水平為(4.21±1.14) μg/L。對(duì)照組血清COL4A3水平為(2.75±0.64) μg/L,患者與健康人的血清COL4A3水平差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。評(píng)估NSCLC患者的臨床病理特征:性別、年齡、吸煙、組織學(xué)類型、腫瘤大小、病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移、癌癥階段及血清COL4A3水平。血清COL4A3水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性參見表1,其中性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),而組織學(xué)類型的比較采用單向ANOVA檢驗(yàn)。血清COL4A3水平與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理分級(jí)及組織學(xué)類型均無關(guān);而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)和臨床分期(P=0.001)相關(guān)。

表1 NSCLC患者凝血變量與臨床病理特征的相關(guān)性Tab 1 Correlation between coagulation variables and clinicopathological characteristics in NSCLC patients

血清COL4A3 預(yù)測(cè)NSCLC患者腫瘤轉(zhuǎn)移及其對(duì)生存時(shí)間的影響從NSCLC患者血清COL4A3的ROC曲線分析中的最佳截?cái)嘀殿A(yù)測(cè)患者腫瘤轉(zhuǎn)移的敏感性(圖1)。當(dāng)血清COL4A3為4.13 μg/L時(shí),敏感性為76.2%,特異性為65.4%,AUC為0.731 (P<0.001,95%CI:0.673～0.837),對(duì)患者臨床分期具有潛在的預(yù)測(cè)價(jià)值(圖1A)。在90例NSCLC患者中,中位血清COL4A3水平為4.13 μg/L,COL4A3高表達(dá)與COL4A3低表達(dá)的患者相比,生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021),低表達(dá)患者的存活時(shí)間更長(zhǎng)(圖1B)。

單/多因素分析CO1L4A3與肺癌預(yù)后相關(guān)的因素單因素分析結(jié)果顯示,患者OS與腫瘤大小、病理組織分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及血清COL4A3水平密切相關(guān);多因素分析結(jié)果顯示,患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期以及血清COL4A3水平與肺癌預(yù)后密切相關(guān)(P<0.05,表2)。提示血清COL4A3水平可能是肺癌患者OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

A:Clinical stage was predicted by ROC curve analysis of serum COL4A3 in patients with NSCLC,and the optimal cutoff value of COL4A3 concentration was 4.13 μg/L.B:OS of 90 patients was showed by Kaplan-Meier curve (P=0.021).
圖1 血清COL4A3的ROC分析預(yù)測(cè)臨床分期及其對(duì)生存期的影響
Fig 1 ROC analysis of serum COL4A3 predicted clinical stage and its effect on overall survival

表2 單因素和多因素分析預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后情況Tab 2 Univariate and multivariate analysis of prognostic valuables for overall survival

COL4A3促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移血清COL4A3高表達(dá)與NSCLC患者不良預(yù)后的相關(guān)性較強(qiáng)。用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人NSCLC細(xì)胞株A549的增殖情況,發(fā)現(xiàn)低濃度COL4A3(5 μg/mL)可促進(jìn)細(xì)胞增殖,高濃度COL4A3(10 μg/mL)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用更強(qiáng)(圖2A)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,COL4A3對(duì)A549細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用呈濃度依賴性,即濃度越高促進(jìn)作用越明顯(圖2B)。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),COL4A3對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用有明顯的濃度依賴趨勢(shì)(圖2C)。

討 論

COL4A3基因高表達(dá)與多種疾病相關(guān),如Alport綜合征、節(jié)段性腎小球硬化、2型糖尿病、高原紅細(xì)胞增多癥及阿爾茲海默癥等,其也是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)基因[15-17]。COL4A3屬于Ⅳ型膠原蛋白家族成員,Ⅳ型膠原蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)-基底膜(basal membrane,BM)的形成和維持中發(fā)揮重要作用,是構(gòu)成BM的主要成分和骨架。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)必須穿透上皮細(xì)胞BM以及圍繞血管的BM,故腫瘤細(xì)胞分泌的Ⅳ型膠原蛋白酶可溶解Ⅳ型膠原蛋白,是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[18]。COL4A3作為Ⅳ型膠原蛋白家族成員,其過度表達(dá)被認(rèn)為與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲密切相關(guān)[19-20]。在腎癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤患者血清中可檢測(cè)出COL4A3高表達(dá),其與腫瘤大小、淋巴管侵襲、靜脈侵襲和TNM分期等腫瘤進(jìn)展的指標(biāo)呈現(xiàn)正相關(guān)[21-23]。在使用順鉑和吉西他濱化療的NSCLC患者中,COL4A3低表達(dá)患者的中位OS明顯高于COL4A3高表達(dá)患者[24]。但是COL4A3影響NSCLC腫瘤進(jìn)程的具體機(jī)制目前尚無報(bào)道,其可否成為NSCLC的診斷標(biāo)志物有待進(jìn)一步研究。

本研究臨床數(shù)據(jù)顯示健康人與NSCLC患者血清COL4A3存在顯著差異,NSCLC患者血清COL4A3表達(dá)水平明顯增高,高表達(dá)組(>4.13 μg/L)的OS明顯低于低表達(dá)組(<4.13 μg/L)(P<0.05)。在NSCLC患者的臨床病理特征中,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期都與COL4A3表達(dá)密切相關(guān):淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清COL4A3水平明顯高于無轉(zhuǎn)移患者(P<0.05),臨床分期Ⅰ、Ⅱ期患者血清COL4A3水平明顯低于Ⅲ、Ⅳ期患者(P<0.05)。說明COL4A3的表達(dá)水平與NSCLC患者腫瘤進(jìn)展程度呈正相關(guān)。單、多因素分析NSCLC預(yù)后相關(guān)因素的結(jié)果發(fā)現(xiàn),COL4A3水平與NSCLC預(yù)后密切相關(guān),提示血清COL4A3高表達(dá)的NSCLC患者可能預(yù)后不良。COL4A3高表達(dá)可加快NSCLC發(fā)展進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),COL4A3可明顯促進(jìn)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖,并呈濃度依賴趨勢(shì);COL4A3可明顯提高NSCLC細(xì)胞的侵襲性,增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力,具有濃度依賴傾向,初步揭示COL4A3高表達(dá)可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。

雖然COL4A3基因在Alport綜合征等疾病中報(bào)道頗多,但其在腫瘤尤其在肺癌中的報(bào)道并不深入。目前肺癌治療仍以鉑類化療藥為主[25],因其嚴(yán)重的不良反應(yīng)和耐藥性成為提高療效的瓶頸,腫瘤的精準(zhǔn)療法已成為研究熱點(diǎn)[26-27]。血清COL4A3水平與NSCLC進(jìn)展密切相關(guān),可能是一種NSCLC患者預(yù)后不良的獨(dú)立標(biāo)志物。COL4A3能顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,有望成為NSCLC治療的新靶點(diǎn),其具體的分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。