劉蓓蓓，曹 林*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

環(huán)境中的重金屬難以被生物降解，會在土壤和水中富集，通過飲用水、植物、畜禽、水產(chǎn)、食用菌（包括野生食用菌）等多種途徑，經(jīng)膳食攝入進入人體，對機體產(chǎn)生慢性損害。據(jù)《2018年中國統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計，截至2017年，我國肉類中豬、牛、羊肉的產(chǎn)量已達到6 557.5萬 t，全國居民人均主要肉類（豬、牛、樣肉）消費量達到23.3 kg，禽類消費量達到8.9 kg[1]。我國各地區(qū)畜禽肉中重金屬污染物水平的安全評價結果顯示，2015—2017年豬肉中鉛、鎘、鉻、汞、砷的平均超標率分別為1.19%、2.48%、1.29%、1.43%及0.62%，其中鎘的超標情況較為嚴重，超標率是砷的4 倍，且華東及西北地區(qū)豬肉中的鎘、西南地區(qū)豬肉中的鉛超標率均在3%之上（含3%）；2015—2017年雞肉中鉛、鎘、鉻、汞、砷的平均超標率分別為2.48%、1.48%、2.24%、0.95%及1.00%，其中鉛和鉻的超標率是汞和砷的2 倍，且華東、華南及西南地區(qū)的雞肉中鉛的超標率最高，均達到3.33%[2]。由此可見，雞肉和豬肉中的鉛鎘污染已成為我國雞肉和豬肉質量安全評價中備受關注的問題。

傳統(tǒng)測定肉中鉛和鎘含量的國家標準方法是石墨爐原子吸收光譜法，測定結果準確，但儀器成本高，檢測費用較昂貴，不適合現(xiàn)場大量快速檢測。目前較常見的是膠體金試紙條，王亞楠[3]、朱旭東[4]和王玉珍[5]等相繼建立Cd2+-Strip（膠體金法），但都屬于定性試紙條，靈敏度較低，且一次測試只能檢測單一重金屬，針對Pb2+的很少。量子點的發(fā)現(xiàn)及應用，為開發(fā)快速、高敏、低成本的食品安全檢測方法帶來了更多的機會。

量子點為主要由II～VI族或III～V族元素組成的納米顆粒，顆粒直徑大約1～10 nm。由于量子點的電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結構會變成具有分子特性的分立能級結構，受激發(fā)后可以發(fā)射熒光[6-7]。量子點的發(fā)射光譜窄，吸收光譜強，能夠實現(xiàn)對不同物質同時進行分辨追蹤，可以通過改變量子點的尺寸大小和化學組成使其發(fā)射光譜覆蓋整個可見光區(qū)。較膠體金或普通熒光素，量子點比表面積更大，微球表面可偶聯(lián)更多的生物活性分子，用于細胞定位、信號傳導、胞內(nèi)組分的遷移及臨床診斷等研究[8-19]，可作為最理想的熒光探針[20-22]。

孟元華等[23]通過量子點熒光探針實現(xiàn)了對大米中Cd2+的檢測；鄧超等[24]建立的CdSe量子點熒光探針，通過熒光淬滅強度測定水樣中Pb2+和Hg2+的質量濃度。但是可同時檢測2 種或2 種以上重金屬的量子點研發(fā)還鮮有報道，檢測2 種重金屬離子的串聯(lián)層析試劑卡迄今仍缺乏有效研究。本研究采用包載CdSe/CdS量子點的聚苯乙烯（polystyrene，PS）微球（CdSe/CdS@PS）作為熒光標記物，其表面含有大量羧基（—COOH），可高效偶聯(lián)單克隆抗體，建立可同時檢測肉中殘留鉛鎘的串聯(lián)卡，借助量子點熒光免疫分析儀，實現(xiàn)精準定量檢測，有效提高試劑靈敏度和準確度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金屬離子標準溶液 中國國家標準物質中心；乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、碳二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)c a r b o d i i m i d e，E D C）、三羥甲基氨基甲烷trihydroxymethyl aminomethane，Tris）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-hydroxyethyl-ethanesulfonic acid，HEPES）、酪蛋白、聚維酮（polyvinylpyrrolidone K30，PVP-K30）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），吐溫20美國Sigma公司；硝酸纖維素膜（HFC09002） 美國Millipore公司；ProClin300防腐劑（P300） 美國Supelco公司；棉漿紙、黏貼板（PVC板）、8965玻璃纖維、樣品墊 上海捷寧生物科技有限公司；蔗糖、98%濃硝酸、濃硫酸 南京化學試劑股份有限公司；鼠抗Cd2+-IEDTA單克隆抗體（3.76 mg/mL）、鼠抗Pb2+-IEDTA單克隆抗體（5.1 mg/mL）、羊抗鼠IgG（5.2 mg/mL）、包載CdSe/CdS量子點的PS微球（CdSe/CdS@PS，5 mg/mL，熒光產(chǎn)率超過90%，包載率高達85%）、Cd2+-IEDTA-BSA（3.86 mg/mL）、Pb2+-IEDTA-BSA（4.47 mg/mL） 南京諾唯贊生物科技有限公司。

量子點稀釋液（1 L）：150 mg蔗糖、30 mg BSA、5 mL吐溫20、2 mL P300，用Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0）定容至1 000 mL，4 ℃保存；活化劑（1 L）：23.4 mg NaCl、2 mL P300，用Tris-HCL緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0）定容至1 000 mL，4 ℃保存；封閉液（1 L）：1 mL乙醇胺、30 mg BSA、2 mL P300，用Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0）定容至1 000 mL，4 ℃保存；包被液（100 mL）：HEPES緩沖液（0.2 mol/L，pH 8.0），加0.2 mg蔗糖、0.2 mL P300，定容至100 mL，4 ℃保存；玻璃纖維處理液（1 L）：50 mg蔗糖、3 mg聚維酮、10 mL吐溫20，用Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0）定容至1 000 mL，4 ℃保存；樣品墊處理液（1 L）：20 mg蔗糖、5 mg酪蛋白、5 mL吐溫20，用Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0）定容至1 000 mL，4 ℃保存。

1.2 儀器與設備

F96pro熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；5430R離心機 美國Eppendorf公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；JA1003A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；WH-1微型旋渦混勻儀 江蘇盛藍儀器制造有限公司；HM3035三維平面點膜噴金儀、ZQ2000微電腦自動斬切機、YK725壓殼機、雙糾偏感應裁條機 上海金標生物科技有限公司；AFS-1000干式熒光免疫分析儀 廣州藍勃生物科技有限公司；Nexion 300D電感耦合等離子體-質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國PE公司；Mars5 Xprass微波消解儀美國CEM公司；100 mL微波消解罐 南京瑞尼克科技開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑組成及原理

圖1 串聯(lián)卡平面示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the dual assay

試劑基本組分包括樣品墊、標記物墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、棉漿紙和PVC板，其中樣品墊和標記物墊均采用吸水玻璃纖維，結構如圖1所示。實驗所用試劑為串聯(lián)試劑：標記物墊上是量子點標記的鼠抗Cd2+-IEDTA單克隆抗體、鼠抗Pb2+-IEDTA單克隆抗體；膜上包被2 種抗原T1和T2（T1為Cd2+-IEDTA-BSA，T2為Pb2+-IEDTA-BSA），上下串聯(lián)，用于特異性結合單克隆抗體；C1和C2為羊抗鼠IgG，用于捕獲未被包被抗原捕獲的單克隆抗體，由于NC膜本身存在最大蛋白吸附量（2 mg/mL），為保證單克隆抗體能充分被捕獲，故包被2 條C線；待測抗原是待測樣本中的Cd2+-EDTA、Pb2+-EDTA，與標記物墊上的單克隆抗體會發(fā)生特異性結合。試劑的工作原理是競爭法，包被抗原與待測抗原競爭結合單克隆抗體，待測抗原越多，可優(yōu)先競爭性結合更多的單克隆抗體，則包被抗原可結合的單克隆抗體就越少，結果導致T線信號值越低，C線信號值越高，信號值T/（C1+C2）與待測抗原含量呈反比。

1.3.2 膜包被

質控線1（C1線）、質控線2（C2線）均為羊抗鼠IgG，包被質量濃度為1.2 mg/mL；檢測線1（T1線）為Cd2+-IEDTA-BSA抗原，檢測線2（T2線）為Pb2+-IEDTA-BSA抗原，包被質量濃度為1.5 mg/mL；用劃膜儀將抗原抗體包被于NC膜上（噴量0.8 μL/cm，檢測線間距4 mm），37 ℃烘干2 h，收取后用鋁箔袋封存，室溫暫放。

1.3.3 玻璃纖維的處理

用裁條機對玻璃纖維進行裁切（30 cm×12 cm），用標記物墊預處理液進行浸泡處理10 min，每張玻璃纖維加液量為（22±0.05）mL，浸泡結束后轉移到干燥網(wǎng)上，放入（37±2）℃鼓風干燥箱干燥16～24 h，收取后用鋁箔袋封存，室溫暫放。

1.3.4 樣品墊的制備

用裁切機對樣品墊進行裁切（30×1.5）cm，用加樣槍取樣品墊處理液進行操作（每條加液量約為（3.40±0.05）mL，加樣結束后靜置5～10 min，轉移到干燥網(wǎng)上于（37±2）℃，鼓風干燥箱干燥16～24 h，收取后用鋁箔袋封存，室溫暫放。

1.3.5 標記物墊的制備

取出CdSe/CdS@PS原液（5 mg/mL），4 ℃超聲10 min，監(jiān)測粒徑和分散系數(shù)，保證微球溶液分散均勻；超聲后取1 mL微球原液于2 只15 mL離心管中，各加入4 mL活化劑混勻后，再加入EDC和待標記抗體（鼠抗Cd2+-IEDTA單克隆抗體和鼠抗Pb2+-IEDTA單克隆抗體）至終質量濃度分別為5 mg/mL和0.075 mg/mL，室溫避光反應1 h；向2 只離心管中各加入1 mL封閉液封閉反應30 min，結束后離心（13 000 r/min，15 min），保留沉淀；用量子點稀釋液重懸沉淀，定容至1 mg/mL，超聲10 min，監(jiān)測粒徑和分散系數(shù)，分析標記情況。標記成功后，將兩管標記溶液混合，重新定容使得混合標記物溶液質量濃度為0.4 mg/mL，混勻后借助噴金儀將溶液均勻噴涂在玻璃纖維上，過夜凍干。

1.3.6 串聯(lián)卡的制備

在PVC板上依次黏貼棉漿紙和NC膜，再黏貼標記物墊和樣品墊，用斬切機裁切成寬度為3.6 mm的試紙條，裝殼、壓殼，制備成試劑卡，鋁箔袋密封后室溫保存。

1.3.7 串聯(lián)卡性能評價

Cd2+-EDTA/Pb2+-EDTA混合液的配制：將1 000 μg/mL的Cd2+和Pb2+標準溶液分別與1 mol/L的EDTA等體積混合，靜置10 min后用0.01 mol/L的PBS（pH 7.2）稀釋成所需的質量濃度2 000、1 000、800、600、400、200、100、40、20、10、5、2、0 ng/mL，再將同質量濃度的2 種溶液等體積混合，常溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

最優(yōu)反應時間的評測：用試紙條檢測質量濃度依次為100、10、0 ng/mL的混合溶液，每個質量濃度設3 個重復，用干式熒光免疫分析儀實時掃描監(jiān)測并記錄T1/（C1+C2）值和T2/（C1+C2）值均達到穩(wěn)定狀態(tài)所需的最少時間，確定不同試劑卡測定不同質量濃度樣本的最優(yōu)反應時間。

檢測限和線性范圍的評價：隨著被測樣品質量濃度的降低，C線信號值呈下降趨勢，直至達到某一質量濃度點時，C線信號值達到最小有效值水平（干式熒光免疫分析儀說明書建議有效信號值大于3 000），此時對應的質量濃度點即為最低檢測限；同理，隨著被測樣品質量濃度的升高，T線信號值達到最小有效值水平時所對應的質量濃度點即為檢測上限。根據(jù)上述判定原理，用試紙條檢測不同濃度的混合溶液，每個質量濃度設5 個重復，求C1均值、C2均值、T1均值、T2均值確定Cd2+和Pb2+的檢測范圍，并對范圍內(nèi)的質量濃度值及對應的T1/（C1+C2）值和T2/（C1+C2）值進行處理，分別建立質量濃度和T1/（C1+C2）值、T2/（C1+C2）值之間的Logit-log回歸直線。

重復性評價：根據(jù)檢測范圍評價結果，參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會EP5-A文件[25]，用檢測卡對高值和低值的混合溶液分別重復檢測20 次，計算20 次測量結果的變異系數(shù)，結果應不大于10%。

特異性評價：用試紙條檢測不同質量濃度的金屬離子-EDTA溶液（Cu2+、Mn2+、Cr3+、Zn2+、Hg2+、Fe3+、Ca2+、Pb2+、Cd2+），配制方法同上，每個質量濃度平行檢測3 次，根據(jù)檢測結果評價試紙條特異性。

1.3.8 比對實驗

實驗室從江蘇南京市棲霞區(qū)攝山星城集貿(mào)市場、玄武區(qū)孝陵衛(wèi)集貿(mào)市場、江蘇省句容市寶華花園農(nóng)貿(mào)市場分別購買豬肉、雞肉各3 份，總計18 份樣本，分別標記為A1～A6、B1～B6、D1～D6（字母A代表攝山星城，B代表孝陵衛(wèi)，D代表寶華；數(shù)字1～3代表不同的豬肉，4～6代表不同的雞肉）。本實驗采用GB 2762—2017《食品中污染物限量》對雞肉和豬肉肉中鉛、鎘的合格情況進行判定。肉類（禽畜內(nèi)臟除外）中鉛和鎘的限量分別為0.2、0.1 mg/kg。實驗樣本取樣量少，為確保消解徹底，減少鉛、鎘的損失，利用微波消解法處理樣本，消化后的樣本用電感耦合等離子體-質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法和串聯(lián)卡檢測樣本，評價串聯(lián)卡的準確率。

樣本預處理：將肉粉碎成勻漿，稱取粉碎后的樣品2.0 g于微波消解罐內(nèi)，依次加入10 mL HNO3和2 mL H2O2，蓋上蓋子密閉放置，過夜后進行微波消解（100 ℃恒溫加熱2 h，120 ℃恒溫加熱2 h，140 ℃恒溫加熱2 h，170 ℃恒溫加熱2 h）。待冷卻后慢打開罐蓋，用少量水沖洗內(nèi)蓋，將消解罐放在消解儀上，在150 ℃條件下趕酸，待溶液約剩1.0 mL時用水洗滌消解罐3～5 次，洗液全部轉移入50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻直接進行ICP-MS測定。測定結束后取5 mL剩余混合液于離心管中，加入5 mL EDTA溶液（0.1 mol/L），反應30 min后離心10 min，取上清液用串聯(lián)卡檢測[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以ICP-MS檢測的Cd2+、Pb2+質量濃度結果分別為橫坐標，對應的串聯(lián)卡檢測結果為縱坐標，用直線回歸分析對數(shù)據(jù)作處理，計算回歸方程。

2 結果與分析

2.1 粒徑分析

標記前后對量子點的粒徑和分散系數(shù)進行監(jiān)測：從分散系數(shù)看，標記前分散系數(shù)較?。s為0.162），表明溶液中顆粒大小較均一，分散度好，標記后分散系數(shù)增加，可能是由于量子點表面修飾抗體后，由于表面電荷的改變產(chǎn)生顆粒凝集，造成凝集團的大小不均一[27]；從粒徑看，標記鎘單抗前后粒徑明顯變化（345.7 nm→383.0 nm），粒徑增大說明標記抗體成功。同理，標記鉛單抗前后分散系數(shù)變大（0.162→0.203），粒徑增大（345.0 nm→365.4 nm），表示標記抗體成功，結果見表1。

表1 粒徑分析Table 1 Particle size analysis

2.2 最優(yōu)反應時間的評測

通過實時監(jiān)測掃描發(fā)現(xiàn)，9 張檢測卡都在1 min內(nèi)完成跑板，T1/（C1+C2）值和T2/（C1+C2）值在5 min內(nèi)均達到穩(wěn)定狀態(tài)不再變化，表示此時已反應充分，故試紙條的最佳反應時間定為5 min。

2.3 檢測限的評價

用試紙條檢測不同質量濃度的混合溶液，當質量濃度小于1 ng/mL時，所對應的C1、C2值均小于3 000，不能排除信號值被背景干擾；當標準品質量濃度為1 ng/mL時，C1、C2值都達到最小有效水平，故可檢測的Cd2+和Pb2+最低質量濃度均為1 ng/mL。混合溶液質量濃度為400 ng/mL時，T1值達到最小有效值水平，且隨著質量濃度的增加，T1值小于3 000，故可檢測的Cd2+上限為400 ng/mL；同理，混合溶液質量濃度為500 ng/mL時，T2值達到最小有效值，故可檢測的Pb2+上限為500 ng/mL，結果見表2。

表2 檢測限的評價Table 2 Limit of detection of the assay

2.4 線性范圍評價

根據(jù)2.3節(jié)結果，對檢測下限和檢測上限之間的質量濃度值及對應的T1/（C1+C2）均值、T2/（C1+C2）均值分別作Logit-log回歸直線，結果顯示r12=0.997，=0.998，且實測值與理論值檢測偏差均在15%以內(nèi)，符合準確度要求；將直線數(shù)據(jù)導入儀器作為標準曲線備用。具體數(shù)據(jù)如表3、4所示。

表3 Cd2+-strip線性范圍評測Table 3 Linear range of the Cd2+ strip

表4 Pb2+-strip線性范圍評測Table 4 Linear range of the Pb2+ strip

2.5 重復性評價

選取線性范圍內(nèi)的高值和低值，用串聯(lián)卡分別重復檢測20 次，精密性高，滿足變異系數(shù)小于10%的要求，結果如表5所示。

表5 試紙條重復性評測Table 5 Repeatability of the strip

2.6 特異性評價

檢測不同金屬離子（Cu2+、Mn2+、Hg2+、Zn2+、Fe3+、Cr3+、Pb2+、Cd2+）的梯度樣本，除Pb2+和Cd2+外檢測結果均小于1 ng/mL，表明樣本中不存在其他金屬離子與Cd2+單抗、Pb2+單抗的非特異性結合，故無交叉反應，見表6。

表6 試紙條特異性評測Table 6 Specificity of the strip

2.7 比對實驗結果

表7 串聯(lián)卡和ICP-MS的檢測結果Table 7 Comparison of results of the dual assay and ICP-MS

由表7可知，除了A5和D3樣本被檢出Cd2+或Pb2+超出限量外，其他被測樣本中的Cd2+和Pb2+含量都比較低，不同來源的動物性食品中殘留Cd2+和Pb2+含量不完全相同。根據(jù)線性相關結果，串聯(lián)卡Pb2+檢測結果與ICP-MS的相關系數(shù)為0.90，Cd2+檢測結果與ICP-MS的相關系數(shù)為0.92，相關性良好。

圖2 紫外燈下異常樣品串聯(lián)卡檢測結果Fig. 2 Results obtained for abnormal samples using the dual assay under ultraviolet illumination

由圖2可知，A1樣本Cd2+和Pb2+均未超出限量，所以C1線和C2線都很淺，肉眼很難辨認；A5樣本只有Cd2+檢測結果超出限量，所以與A1相比，T1線條顏色略淺、C1線條顏色略深；D3樣本Cd2+和Pb2+均超出限量，C1和C2線條顏色較深，T1和T2線條顏色淺。

3 討 論

Chen Jianlin等[28]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過L-半胱氨酸修飾的CdSe量子點，穩(wěn)定性和熒光強度均明顯提高，其表面基團與Hg2+的親和力強，利用Hg2+濃度對量子點熒光強度的影響，建立了一種簡便、快速測定Hg2+的方法，該方法對Hg2+的檢出限可達6.0×10-9mol/L；周華健等[29]利用量子點對金屬離子具有熒光響應的特性，以CdTe量子點為熒光探針實現(xiàn)了對水溶液中Ni2+的檢測。但以上所用的量子點均為單核量子點（CdSe或CdTe），其電子與空穴均處于離域狀態(tài)，且大部分原子都以缺陷態(tài)存在，而這些缺陷態(tài)又具有捕獲電子或者空穴的能力[30]，會導致熒光不穩(wěn)定，大大降低量子點的發(fā)光效率。實驗所用的CdSe/CdS量子點為核殼型量子點，其電子與空穴都主要被限域在核內(nèi)，抵御環(huán)境影響的能力會大大提升，同時可以提高核心材料的發(fā)光性能和穩(wěn)定性能[30]。

文獻[31]報道可以通過有機配體包載核殼量子點來保護絕大多數(shù)原子，同時配體可以使量子點相互間的距離加大防止聚集，使得量子點溶液更加穩(wěn)定的存在。雖然普通的核殼量子點，熒光強度高，但表面含有大量疏水基團，無法與抗體等分子直接偶聯(lián)。如何有效地將抗體偶聯(lián)在量子點表面并保持其生物學活性，是量子點免疫分析應用中至關重要的一步。

孟元華等[23]研制的檢測大米中的鎘的CdSe/CdS量子點熒光探針，將經(jīng)硼氫化鈉還原的BSA修飾在CdSe/CdS量子點表面形成dBSA-量子點，量子點熒光在待測的Cd2+作用下會增強，通過熒光變化量來測定Cd2+含量，但所用熒光探針對溫度和pH值有嚴格要求，特別是酸性條件下，量子點的熒光性能受較大干擾，會影響檢測靈敏度。因此，如何提高其發(fā)光穩(wěn)定性具有重要的科學意義[32]。

此外，以上所提及的量子點技術都是對單一重金屬的檢測。實驗所用CdSe/CdS量子點包載在PS內(nèi)部，能夠避免量子點與外界環(huán)境的直接接觸，量子點抗光漂白性能強；同時微球表面的親水性集團易于生物分子偶聯(lián)，可實現(xiàn)對不同種單克隆抗體的高效標記。此外，干式熒光免疫分析儀的使用，有效保證了定量檢測的實現(xiàn)。儀器的內(nèi)置光源（360 nm紫外光）可激發(fā)試劑卡上信號區(qū)聚集的量子點，測量系統(tǒng)運用光電掃描試劑卡信號區(qū)，然后對光電信號的強弱進行測量處理，定量分析出待測物的濃度，儀器檢測變異系數(shù)小于1%，穩(wěn)定性相對偏倚小于±2%。以上條件建立的串聯(lián)檢測卡，實現(xiàn)了對肉中鉛、鎘的同時檢測，提高了試紙條的靈敏度（1.0 ng/mL）、準確度（檢測變異系數(shù)小于10%）、檢測時間（5 min）。將來甚至可建立同時檢測3 種或3 種以上重金屬的聯(lián)卡，配套專用的小型量子點熒光定量分析儀，即可實現(xiàn)食品中重金屬的日常定量檢測。