(中國人民解放軍陸軍第八三集團軍醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

膠質瘤是一種常見的預后較差的腦腫瘤，其中包括成年膠質母細胞瘤、間變性少突膠質細胞瘤、兒童膠質母細胞瘤和彌漫性內分泌神經膠質瘤[1]。其五年生存率為0%～60%，迫切需要新的治療方法[2]。EGFR基因擴增在膠質瘤中常見，但EGFR TKI療效欠佳[3]。一項Ⅲ期臨床試驗結果表明，新診斷的EGFRvIII表達的膠母患者使用Rindopepimut 生存期未延長。Rindopepimut對膠母患者的免疫療效可能需要通過聯(lián)合用藥來實現。一項Ⅱ期臨床試驗結果表明，成人復發(fā)低級別膠質瘤使用mTOR抑制劑依維莫司后疾病較穩(wěn)定，6個月PFS為84%，12個月PFS為47%。依維莫司的抗腫瘤作用同時存在腫瘤血管結構異常。以上結果支持依維莫司在低級別膠質瘤中做進一步探索。研究旨在解析膠質瘤細胞對EGFR TKI的療效，以及探討LKB1/Akt/mTOR信號通路在膠質瘤細胞對抗EGFR TKI的耐藥的作用和分子機制，這為膠質瘤EGFR TKI等靶向治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

選用SPF級別的BALB/C荷瘤鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，雄性，體重18～22 g，6～8 周齡，在SPF 級條件下無菌層流飼養(yǎng)，恒溫恒濕，所有的飲用水和食物均進行滅菌。所有動物實驗操作符合動物實驗標準操作規(guī)程，遵循實驗動物倫理委員會相關規(guī)定。Western Blot所需試劑購自中國碧云天公司；pEGFR/EGFR抗體，pAkt/Akt抗體，pS6K/S6K抗體，pERK/ERK抗體，pSTAT3/STAT和LKB1抗體和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均購于美國Bioworld公司。厄洛替尼，LKB抑制劑1093222-27-5和Akt抑制劑LY294002購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

膠質瘤細胞株U87購自美國標準菌庫(American type culture collection, ATCC)；穩(wěn)定表達EGFRvIII的U87細胞株由天津醫(yī)科大學提供。U87細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入100 U/mL的青霉素和100 U/mL的鏈霉素，置于培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT法

細胞以5 000個/孔的密度種植于96孔板內，當細胞生長融合達70%時，給予細胞相應處置，細胞轉染48 h后給予相應藥物處理，若無需轉染直接用藥物處理24 h，然后進行檢測。為了避免藥物處理時間過長導致混雜因素過多，藥物處理時間不超過24 h。藥物處理時間達到預定時，每孔加入10μL MTT，在37℃孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄掉孔內液體，避光條件下加入200 μL 二甲基亞砜，放置搖床晃動10 min使結晶物充分溶解。用酶標儀于490 nm波長處測定各孔的吸光度值，并記錄結果。

1.4 Western Blot

建模6 h、24 h和48 h后處死大鼠，剝離海馬到EP管內放置-80℃冰箱中儲存。復蘇后將組織研磨并加入RIPA裂解在SDS-PAGE電泳凝膠上分離。轉移到PVDF膜，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。ECL檢測標記信號。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 厄洛替尼上調AKT和S6K蛋白磷酸化水平

檢測厄洛替尼作用于EGFR野生型U87細胞和EGFRvIII U87細胞，Western Blot檢測可見pEGFR表達水平顯著降低，而AKT和S6K蛋白磷酸化水平明顯增加，同時可見ERK和STAT3磷酸化水平無明顯變化。見圖1。采用siRNA 下調LKB，與對照組相比，厄洛替尼增加的Akt和S6K磷酸化水平受到顯著抑制。見圖2。

圖1 厄洛替尼作用于EGFR野生型和EGFRvIII U87細胞的蛋白

圖2 LKB siRNA處理厄洛替尼Akt和S6K蛋白磷酸化

2.2 LKB抑制劑和Akt抑制劑可克服厄洛替尼耐藥

厄洛替尼并未改變膠質瘤細胞的EGFR野生型U87細胞和EGFRvIII U87細胞活性，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LKB抑制劑和Akt抑制劑明顯降低腫瘤活性，而MEK抑制劑并無相關作用。見圖3。

圖3 厄洛替尼作用于EGFR野生型和EGFRvIII U87細胞活性

2.3 LKB抑制劑和Akt抑制劑聯(lián)合厄洛替尼抑制荷瘤鼠腫瘤增長

采用EGFR野生型U87細胞種植荷瘤鼠，與對照組相比，厄洛替尼聯(lián)合LKB抑制劑可顯著降低腫瘤生長，如圖4a所見，而厄洛替尼、LKB抑制劑并不影響荷瘤鼠腫瘤大小。與對照組相比，厄洛替尼聯(lián)合Akt抑制劑可顯著降低腫瘤生長，如圖4b所見，而厄洛替尼、Akt抑制劑并不影響荷瘤鼠腫瘤大小。

圖4 厄洛替尼聯(lián)合LKB/Akt抑制劑作用于荷瘤鼠

3 討論

目前腫瘤治療為精準靶向和個體化治療，尤其是在基因突變較少的兒童低級別膠質瘤中，MAPK信號通路BRAF基因變異常見膠質瘤中[2]。BRAF V600E突變的低級別兒童膠質瘤患者對常規(guī)放化療不敏感，10年的無進展生存率(DFS)為27% ，顯著低于BRAF野生型60.2%[3]。兒童膠母中較常見的致癌基因融合約占10%，MET基因融合激活MAPK信號通路，破壞細胞周期調控，誘導腫瘤進展[3]。MET抑制劑的模型研究發(fā)現其能抑制MET突變的腫瘤生長。PI3K/ATK/mTOR信號通路的抑制在一項Ⅱ期臨床試驗結果表明，成人復發(fā)低級別膠質瘤使用mTOR抑制劑依維莫司后疾病較穩(wěn)定。本研究檢測厄洛替尼作用于EGFR野生型U87細胞和EGFRvIII U87細胞，Western Blot檢測可見pEGFR表達水平顯著降低，而AKT和S6K蛋白磷酸化水平明顯增加，同時可見ERK和STAT3磷酸化水平無明顯變化。采用siRNA 下調LKB，與對照組相比，厄洛替尼增加的Akt和S6K磷酸化水平受到顯著抑制。厄洛替尼并未改變膠質瘤細胞的EGFR野生型U87細胞和EGFRvIII U87細胞活性，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LKB抑制劑和Akt抑制劑明顯降低腫瘤活性，而MEK抑制劑并無相關作用。此外，還有其他靶向治療藥物，比如CDK4/6 抑制劑帕布利昔布，其可抑制mTOR下游信號通路活性，使mTOR信號通路激活。依維莫司抑制mTOR通路，激活Ras的介導ERK，帕布利西布可結合抑制ERK。依維莫司與帕布利昔布組合治療顯著干擾了膠質母細胞瘤(GBM)的代謝，導致大量細胞凋亡，且依維莫司顯著提高了帕布利昔布在腦中的濃度。CDK4/6與mTOR抑制劑對GBM有治療潛力，建議開展臨床試驗進一步評估。DS7423為PI3K/mTOR雙靶點抑制劑, 在小鼠中能穿越血腦屏障。DS7432對PI3K通路激活且PTEN失活的膠母細胞系有抑制作用[4，5]。NVP-BEZ235是 PI3K/mTOR 雙靶點抑制劑, 能增強放療對成人和兒童膠母細胞系中的殺傷作用并導致早期的腫瘤代謝改變，此變化通過核磁共振光譜呈現。隨著一代mTOR抑制劑雷帕霉素、二代mTOR抑制依維莫司等的涌現，耐藥問題也隨之而來，而三代mTOR抑制劑Rapalink-1的研究為耐藥問題帶來曙光。

總之，本研究表明LKB1/Akt/mTOR通路參與膠質瘤細胞對EGFR TKI耐藥，通路抑制劑可改善TKI耐藥，這為膠質瘤克服EGFR TKI靶向治療提供理論依據。