陳運(yùn)杰，郭欣妍，楊 藝，王 娜①，楊 燁

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042)

抗生素作為畜禽感染性疾病治療藥物及動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)添加劑，在養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮著非常重要的作用[1]。然而，長(zhǎng)期大量依賴抗生素的養(yǎng)殖方式，可誘導(dǎo)動(dòng)物腸道菌群產(chǎn)生大量攜帶抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的耐藥菌(antibiotics resistance bacteria，ARBs)，且耐藥菌會(huì)隨排泄物最終進(jìn)入環(huán)境[2-3]；同時(shí)，抗生素藥物母體和代謝產(chǎn)物隨著糞便等排泄物直接進(jìn)入土壤、水等環(huán)境介質(zhì)中，又增加了環(huán)境微生物的進(jìn)化選擇壓力，將誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生耐藥性[4]。

最近一些研究認(rèn)為，植物根際是耐藥基因轉(zhuǎn)移的“熱區(qū)”[5]。植物根際指受植物根系的影響，在物理、化學(xué)和生物學(xué)特性上不同于周圍土體的根表面微域土區(qū)，是土壤水分、養(yǎng)分和有益或有害微生物進(jìn)入植物根系的門戶。在根際范圍內(nèi)，微生物種類豐富，能量和物質(zhì)代謝活躍，根際生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)成分滲出會(huì)影響細(xì)胞密度、分布以及土壤細(xì)菌的代謝能力，一些抗生素的抗性效應(yīng)在此區(qū)域內(nèi)會(huì)進(jìn)一步得到加強(qiáng)。REICHEL等[6]研究了施用含磺胺嘧啶(SDZ)和二氟沙星(DIF)的糞肥后玉米根際土壤與非根際土壤的微生物結(jié)構(gòu)多樣性，對(duì)63 d中宇宙試驗(yàn)的土壤樣品磷脂脂肪酸(PLFA)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，施用含SDZ和DIF的糞肥增加了土壤中革蘭陰性菌和真菌數(shù)量，但是根際土壤微生物菌群的變化與非根際土壤相比并不十分明顯；通過(guò)分析PCR-DGGE條帶發(fā)現(xiàn)，條件致病菌假單胞菌屬(Pseudomonas)在根際土壤中的增加更為顯著。這表明植物根際環(huán)境可能促進(jìn)土壤微生物群落產(chǎn)生耐藥性，也可能促使糞肥中抗性基因在微生物間水平轉(zhuǎn)移。因此，植物根際可能是影響ARGs增殖與傳播行為的重要環(huán)境。但迄今為止，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，研究角度比較單一，且所研究的抗生素品種主要集中于磺胺類抗生素，僅局限于施用含抗生素的糞肥后植物根際微生物多樣性變化[6]，以及植物根際部位磺胺類抗生素及其抗性基因(sul1、sul2和sul3)的表觀分布規(guī)律[7-8]。

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)報(bào)告指出，人畜共用抗生素的使用會(huì)大大增加動(dòng)物與人體內(nèi)抗性細(xì)菌交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)人體健康造成極大危害[9]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(包括紅霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素和羅紅霉素等)不僅在臨床上作為青霉素過(guò)敏患者的替代藥物而發(fā)揮著重要作用，對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)也是廣泛使用的一類獸藥品種。目前，關(guān)于養(yǎng)殖業(yè)抗性基因的報(bào)道以四環(huán)素和磺胺類為主，但有關(guān)養(yǎng)殖行業(yè)使用頻率同樣較高的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素所導(dǎo)致的ARGs(主要為erm基因)傳播擴(kuò)散問(wèn)題對(duì)人體健康的隱患更為嚴(yán)重。這是由于大環(huán)內(nèi)酯類ARGs是一類較為穩(wěn)定的抗性基因，在土壤中殘留豐度相對(duì)更高。JOY等[10]在豬糞中檢出金霉素、泰樂(lè)菌素及其對(duì)應(yīng)的抗性基因tet和erm，在40 d的堆肥過(guò)程中，雖然泰樂(lè)菌素降解90%，但其對(duì)應(yīng)的ermB基因卻只降解40%。KNAPP等[11]對(duì)荷蘭和蘇格蘭不同地區(qū)農(nóng)田土壤中抗性基因進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示大環(huán)內(nèi)酯類ARGs(ermB、ermC、ermE和ermF)豐度隨著時(shí)間的推移而呈遞增趨勢(shì)。SU等[12]研究發(fā)現(xiàn)，廣東東江流域水底沉積物中ermB、ermC和ermF這3種大環(huán)內(nèi)酯類ARGs也存在較高豐度(105～1011copies·g-1)?？梢?jiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因的環(huán)境潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。

筆者以污染隱患較大的大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(erms)為研究對(duì)象，采用陸生微宇宙模擬試驗(yàn)方法，在人工控制條件下模擬目標(biāo)污染物進(jìn)入土壤中的分布行為。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR)技術(shù)探明植物根際對(duì)erms在土壤中演變與歸趨的影響規(guī)律，以及其在土壤剖面的垂直分布規(guī)律，為闡明erms在農(nóng)田環(huán)境中傳播擴(kuò)散機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，也為建立抗性基因的生態(tài)環(huán)境安全評(píng)價(jià)和預(yù)警體系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 微宇宙試驗(yàn)方法的建立

1.1.1糞肥的收集

供試動(dòng)物糞肥采集于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地。選取1頭育肥豬，首先在不飼喂任何抗生素藥物情況下培育2個(gè)月，之后添加抗生素藥物飼喂，方法為每天將1 g硫氰酸紅霉素溶于8 L水中，令其自由飲用，連續(xù)飲用4 d，采集7 d內(nèi)產(chǎn)生的豬糞便。糞便經(jīng)短期堆肥腐化后收集并于-20 ℃條件下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2土柱單元設(shè)置

陸生微宇宙系統(tǒng)的土芯取自生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)用地，土壤為水稻土，其基本理化性質(zhì)：pH為6.23，w(有機(jī)碳)為49.8 g·kg-1，離子交換量為18.0 cmol·kg-1，w(黏粒)為19.4%，w(粉粒)為75.8%，w(砂粒)為4.8%。土柱桶材質(zhì)為聚乙烯，內(nèi)徑為17 cm，高度為60 cm(包括0.15 m厚種植層土和0.45 m厚深層土)。填裝土柱前，用電子混勻機(jī)將糞肥和水稻土(以干重計(jì))按照1∶25質(zhì)量比充分混合，用水稻土填裝深土層(0.45～0.6 m)后，再用糞肥-土壤混合物填裝種植層(0～0.15 m)。土柱填裝后先對(duì)土柱進(jìn)行預(yù)淋溶，使土柱持水，之后按正常種植方式種植玉米并正常管理，每日適量補(bǔ)水保持土柱質(zhì)量含水率為8.5%～15.2%。微宇宙系統(tǒng)的溫度恒定設(shè)為21 ℃，采用鹵鎢燈(400 W)控制光照周期為t(光)∶t(暗)=16 h∶8 h[13]。以種植玉米的土柱作為試驗(yàn)組，以不種植玉米的土柱作為對(duì)照組(CK)，其余處理方式與種植玉米的試驗(yàn)組完全相同。

1.2 樣本采集

玉米種子購(gòu)于南京潤(rùn)祥種業(yè)有限公司(品名：江南花糯，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所研制)，每柱播種3粒種子，待預(yù)生長(zhǎng)1周后，每柱僅保留1株生長(zhǎng)良好的幼苗作為試驗(yàn)用玉米株，并以此作為玉米生長(zhǎng)的第0天(D0)。之后分別于生長(zhǎng)7、14、28、42、56和63 d(D7、D14、D28、D42、D56和D63)時(shí)采集土樣，主要分為2個(gè)部分：(1)對(duì)試驗(yàn)組土柱中根際(rhizosphere，RH)和非根際(bulk soil，BK)土樣進(jìn)行采集。參照文獻(xiàn)[7]，采用抖動(dòng)植物根際方式采集貼近根系0～4 mm的根際土壤約5 g，而非根際土壤則使用圓形取樣器(高為9.2 cm，內(nèi)徑為1.2 cm)采集同一土柱中表層(0～0.1 m)土壤獲得。(2)在每個(gè)采樣時(shí)段利用特制的推土裝置將試驗(yàn)組和對(duì)照組(CK)土芯整體推出后，同時(shí)取0～0.2、>0.2～0.4和>0.4～0.6 m這3段各自混為1個(gè)樣品。所有樣品均采集3個(gè)平行樣，混合后置于無(wú)菌保鮮袋中，于4 ℃條件下無(wú)菌保存。

1.3 土壤總DNA(gDNA)的提取

土壤gDNA提取參照PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，DNA洗脫液于-80 ℃條件下保存待用。采用w=1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和Nandrop1000對(duì)提取的gDNA質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

1.4.1PCR擴(kuò)增抗性基因特異性片段

所涉及的目標(biāo)基因主要包括4種大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(ermB、ermC、ermF和ermX)和16S rDNA(作為分析時(shí)的內(nèi)參基因)，引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[14]，具體信息見(jiàn)表1。以土壤gDNA為模板，PCR反應(yīng)過(guò)程：94 ℃預(yù)變性300 s，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，適當(dāng)退火溫度(Tm)下退火30 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃終延伸360 s結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)體系為12.5 μL 的2×ES Taq MasterMix，1 μL 上游引物(10 μmol)，1 μL下游引物(10 μmol)，1 μL模板DNA(<500 ng)，9.5 μL的RNase-free水，反應(yīng)體系總體積為25 μL。

表1 qPCR引物序列

Table 1 Primer sequence for qPCR

基因名稱引物名稱退火溫度/℃產(chǎn)物大小/bpermBFW: ACCTTGGATATTCACCGAAC58119RV: CTTTGGCGTGTTTCATTGCTermCFW: ACTGCCATTGAAATAGACCA56292RV: TAGCAAACCCGTATTCCACermFFW: AAGAAATTGCCCGTTCGTT55274RV: ACTTGAACATTTCGGGCATCermXFW: AAATTTTCTCACCGACCACA62219RV: AGTACAGCGTCAGTCCA16SrDNAFW: CAATGGACGAAAGTCTGACG60146RV: ACGTAGTTAGCCGTGGCTTT

1.4.2目的基因的純化與擴(kuò)增

將含目的基因片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行w=1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，利用PCR純化試劑盒(EasyPure Qucik Gel Extraction Kit)對(duì)目的基因條帶進(jìn)行純化回收。將目的基因轉(zhuǎn)染至Trans-T3感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆培養(yǎng)。最后，利用Axy Prep Plasmid Miniprep Kit提取質(zhì)粒DNA，再由蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序以檢測(cè)目的基因片段是否插入。

1.4.3基因拷貝數(shù)計(jì)算

利用Nanorop1000對(duì)所提取質(zhì)粒純度和DNA含量進(jìn)行檢測(cè)，若A260/A280介于1.8～2.0之間且A260/A230>2.0，則認(rèn)為是純DNA，否則需進(jìn)一步純化。參照文獻(xiàn)[15]，將質(zhì)粒濃度換算為1 μL質(zhì)粒溶液所攜帶的絕對(duì)模板拷貝數(shù)(y，copies·μL-1)公式為

y=[x/(a+b)×660]× 10-9× 6.02 × 1023。

(1)

式(1)中，x為質(zhì)粒濃度，ng·μL-1；a為載體長(zhǎng)度，bp；b為目的基因長(zhǎng)度，bp。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將已知初始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋濃度分別為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9，再進(jìn)行qPCR檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)果經(jīng)熒光定量軟件分析得到對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)(Ct，Y)，以其作為縱坐標(biāo)，以拷貝數(shù)的lg值(X)作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4種大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因及16S rDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表2。

在qPCR中，隨著循環(huán)數(shù)的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的指數(shù)擴(kuò)增后，擴(kuò)增曲線趨于穩(wěn)定，出現(xiàn)“平臺(tái)效應(yīng)”，即隨著模板擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，由于其熒光強(qiáng)度和循環(huán)數(shù)不同，從而得到不同循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系圖，即擴(kuò)增曲線。以ermB為例，其擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線和熔融峰見(jiàn)圖1(a)～(d)。

表2 大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因及16S rDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

Table 2 Standard curve equation of macrolides antibiotic resistance genes and 16S rDNA

目標(biāo)基因 線性方程 決定系數(shù)R2擴(kuò)增效率E/%ermBY=-3.423X+39.1200.99596.1ermCY=-3.418X+37.8820.99999.2ermFY=-3.439X+37.9820.99995.3ermXY=-3.311X+36.5410.998100.516S rDNAY=-3.345X+38.3570.99997.3

X為目標(biāo)基因拷貝數(shù)的lg值，Y為循環(huán)數(shù)。

圖1 ermB基因的擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線和熔融峰

1.5 抗性基因(ARGs)的定量分析

以16S rDNA為內(nèi)參基因，使用qPCR技術(shù)對(duì)ermB、ermC、ermF和ermX 4種大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因進(jìn)行定量分析，反應(yīng)體系為5 μL 的2×UltraSYBR Mixture，0.2 μL上游引物(10 μmol)，0.2 μL下游引物(10 μmol)，1 μL模板DNA(10～100 ng)，3.6 μL 的RNase-free 水，反應(yīng)體系總體積為10 μL。

qPCR反應(yīng)于CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detextion System(Bio-Rad，USA)儀器上進(jìn)行，采用三步法進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性10 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性15 s，適當(dāng)退火溫度(表1)下退火30 s，72 ℃延伸30 s。溶解曲線程序按照儀器默認(rèn)值設(shè)置，從60 ℃上升到95 ℃，其間每隔0.5 ℃采集1次熒光以生成溶解曲線，根據(jù)溶解曲線變化檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果的特異性。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，以P<0.05表示組間差異顯著。大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(erms)相對(duì)豐度為erms濃度與16S rDNA濃度的比值，即erms∶16S rDNA的計(jì)算值。采用OriginLab 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際(RH)與非根際(BK)土壤中大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因的分布

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到RH和BK土壤中大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(erms)相對(duì)豐度。如圖2所示，4種大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因均可檢出，相對(duì)豐度范圍大致為10-4～10-1。在檢測(cè)的2種土壤中，ermF和ermX相對(duì)豐度較高，為10-3～10-1；其次為ermB，為10-3～10-2；而ermC相對(duì)豐度最低，為10-4～10-3。如表3所示，BK土壤中ermC、ermF和ermX在7 d時(shí)的相對(duì)豐度均顯著高于RH土壤(P<0.05)，而63 d時(shí)，除ermF基因外，RH和BK土壤中抗性基因相對(duì)豐度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖2 根際(RH)和非根際(BK)土壤中大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因相對(duì)豐度

圖2顯示，在63 d的試驗(yàn)周期內(nèi)，隨著玉米生長(zhǎng)時(shí)間的推移，BK土壤中erms相對(duì)豐度總體呈下降趨勢(shì)，而RH土壤中4種抗性基因相對(duì)豐度變化均呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)，部分抗性基因在63 d時(shí)出現(xiàn)增殖。具體表現(xiàn)為7 d時(shí)，BK土壤中ermB、ermC、ermF和ermX相對(duì)豐度分別為4.72×10-2、1.98×10-3、7.13×10-1和1.75×10-2，而63 d時(shí)則分別為1.74×10-3、3.24×10-4、3.53×10-3和2.28×10-3，其增幅分別為-96.3%、-83.6%、-99.5%和-87.0%。類似地，RH土壤中4種抗性基因相對(duì)豐度增幅則分別為-88.3%、103.0%、-88.6%和71.5%。

28 d之前，土壤中抗性基因相對(duì)豐度表現(xiàn)為BK > RH，但28 d時(shí)，RH土壤中erms相對(duì)豐度開(kāi)始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在42 d后表現(xiàn)為RH > BK，且除ermB基因(42 d時(shí))和ermF基因(42、63 d)外，其余差異性并不顯著(表3)。

2.2 剖面土壤中大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因垂直分布

種植玉米(MA)和未種植玉米(CK)剖面土壤中抗性基因相對(duì)豐度見(jiàn)圖3。在MA和CK土壤中，4種erms均能被檢測(cè)到，且相對(duì)豐度隨著玉米生長(zhǎng)周期的增加呈下降趨勢(shì)。與RH和BK土壤中抗性基因相對(duì)豐度的檢測(cè)結(jié)果相似，MA和CK剖面土壤中ermF和ermX相對(duì)豐度較高，ermB和ermC相對(duì)豐度較低。MA土壤中ermB、ermC、ermF和ermX相對(duì)豐度分別為10-6～10-2、10-6～10-3、10-4～10-2和10-4～10-3，較CK土壤的10-7～10-3、10-6～10-4、10-5～10-2和10-5～10-3高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。總體而言，MA各土壤層中erms相對(duì)豐度高于CK土壤。

表3 根際和非根際土壤中抗性基因顯著性差異P值分析

Table 3 Variance analysis of ARGs relative abundance in rhizosphere and bulk soil

抗性基因不同時(shí)間(d)P值71428425663ermB0.0670.9830.1300.0190.1280.368ermC0.0350.0730.0300.1580.0780.137ermF0.0280.0220.2860.0220.1920.027ermX0.0470.4610.3950.0820.0620.051

就0～0.2 m土層而言，無(wú)論是MA還是CK土壤，4種erms均可檢出，其中ermF相對(duì)豐度最高，在10-1～10-2之間，ermC相對(duì)豐度最低，在10-4～10-3之間。就>0.2～0.4 m土層而言，MA土壤中除了ermB直到42 d時(shí)才被檢測(cè)到以外，其余3種抗性基因在不同采樣時(shí)間均可被檢測(cè)到，且相對(duì)豐度呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)；而就CK土壤而言，除了ermB在56 d之后才被檢測(cè)到以外，其余3種抗性基因在不同采樣時(shí)間均可被檢測(cè)到；在同一采樣時(shí)間，MA土壤中erms相對(duì)豐度高于CK土壤。就>0.4～0.6 m土層而言，28 d之前，MA土壤中4種erms均未檢出，其中ermC和ermF在28 d之后才檢出，ermB 在42 d之后才檢出，ermX則在56 d之后檢出；而對(duì)于CK土壤，除了ermC較早被檢測(cè)到(28 d時(shí))以外，ermB和ermF直到56和42 d之后才檢出，ermX始終未檢出。

MA和CK分別指種植玉米和未種植玉米土壤不同深度土層中抗性基因相對(duì)豐度。就同一幅圖而言，同一組直方柱上方

通過(guò)對(duì)剖面土壤中抗性基因垂直分布的研究發(fā)現(xiàn)，不同抗性基因在土層中的分布也有顯著差異(圖3)，例如，MA土壤0～0.2 m土層中ermB基因(42 d時(shí))相對(duì)豐度比>0.4～0.6 m土層高1 000倍，而ermC相對(duì)豐度則高100倍。隨著剖面土壤深度的增加，抗性基因相對(duì)豐度逐漸下降，各土層抗性基因相對(duì)豐度由大到小依次為0～0.2、>0.2～0.4和>0.4～0.6 m。

3 討論

筆者研究中，在63 d的采樣周期內(nèi)，非根際(BK)土壤中ermC、ermF和ermX相對(duì)豐度在7 d時(shí)均顯著高于RH土壤(P< 0.05)，這可能與非根際土壤主要取自含有糞肥的耕作層(0～0.1 m)有關(guān)。POPOWSKA等[16]從動(dòng)物糞便堆肥樣本和施用糞肥的農(nóng)田及有機(jī)果園土壤樣本中分離得到紅霉素耐藥菌，采用定性PCR技術(shù)檢測(cè)到耐藥菌攜帶有ermC、ermV、ermX、msrA、oleB和vg基因，可見(jiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因通過(guò)糞便施肥會(huì)廣泛進(jìn)入環(huán)境并進(jìn)一步傳播擴(kuò)散。隨著時(shí)間的推移，BK土壤中erms相對(duì)豐度總體呈下降趨勢(shì)，63 d時(shí)抗性基因相對(duì)豐度比7 d時(shí)增加-99.5%～-83.6%，這可能是因?yàn)樵谝欢屋^長(zhǎng)時(shí)間后，由于土壤中抗生素逐漸降解，在缺少外源壓力的情況下，相應(yīng)的抗性基因表現(xiàn)為相對(duì)穩(wěn)定或持續(xù)性緩慢下降[17]。而在RH土壤中抗性基因相對(duì)豐度增幅則為-88.6%～103.0%，erms相對(duì)豐度總體變化趨勢(shì)較BK更穩(wěn)定，63 d時(shí)4種抗性基因相對(duì)豐度均超過(guò)BK土壤，暗示根際對(duì)erms豐度的維持具有一定作用，使得根際周圍的土壤更有可能成為抗性基因的“蓄積池”。

在28 d之前，BK土壤中erms相對(duì)豐度均高于RH土壤，但28 d之后RH開(kāi)始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在42 d之后出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為RH土壤中erms相對(duì)豐度高于BK土壤。RH土壤中erms的這種逆轉(zhuǎn)情況可能與玉米生長(zhǎng)過(guò)程中根際分泌物不同，進(jìn)而引起根際周圍攜帶有抗性基因的微生物群落變化有關(guān)[18]。根據(jù)玉米的生長(zhǎng)周期，28 d之后，玉米正處于生長(zhǎng)的關(guān)鍵期——穗期，此時(shí)根系繼續(xù)擴(kuò)展，受其分泌物的持續(xù)性影響，根際周圍土壤養(yǎng)分更為豐富，微生物多樣性和豐富度顯著高于非根際[19]。研究顯示，erm基因容易被質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子等水平基因移動(dòng)原件(HGT)捕獲，可以非常容易地在不同宿主細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移[12]。BRANDT等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在添加人工根際滲出液作為碳源后，土壤中磺胺嘧啶(SDZ)的細(xì)菌群落抗性和相應(yīng)的磺胺類抗性基因大大增加，這可能是因?yàn)?SDZ 耐藥菌得到增殖。JECHALKE等[21]研究了植物根際對(duì)SDZ抗性轉(zhuǎn)移的影響作用，發(fā)現(xiàn)玉米和青草的根際區(qū)域抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)移率明顯增加，同時(shí)結(jié)果顯示植物的不同品種及不同發(fā)育周期會(huì)對(duì)土壤微生物活性的促進(jìn)作用以及抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生影響。

通過(guò)對(duì)剖面土壤中抗性基因垂直分布的研究發(fā)現(xiàn)，4種erms在不同深度土層中的分布不一，且種植玉米(MA)土壤中抗性基因相對(duì)豐度顯著高于未種植玉米(CK)土壤。隨著縱向距離的加深，抗性基因檢出頻率和豐度也相應(yīng)呈遞減趨勢(shì)。JOY等[10]研究發(fā)現(xiàn)，糞便耐藥菌攜帶的sul1、sul2和ermF 基因容易隨著雨水而滲透土層，徑流至周邊的地表水或逐漸滲透至地下水，說(shuō)明抗生素抗性基因具有能夠沿著土壤界面向下遷移的能力，繼而可能會(huì)對(duì)地下水造成污染，具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

隨著土壤深度的增加，土壤養(yǎng)分和含氧量逐漸下降，從而使得土壤中微生物多樣性呈現(xiàn)差異性分層，進(jìn)而導(dǎo)致攜帶抗性基因微生物豐度隨著土壤深度增加而減少[22]。RYSZ等[23]研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌(Escherichiacoli)在厭氧環(huán)境下易丟失抗性基因，含氧量高低將會(huì)影響微生物對(duì)抗性基因的保持能力。因此，土壤含氧量變化會(huì)對(duì)抗性基因豐度產(chǎn)生影響。此外，抗性基因在土壤中的傳播還與可移動(dòng)基因元件存在密切關(guān)系[12]，因而呈現(xiàn)不同抗性基因在土壤垂直分層中的分布存在顯著差異(P< 0.05)。MA土壤中4種erms相對(duì)豐度范圍為 10-6～10-2，較CK土壤(10-7～10-2)高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，而在同一采樣時(shí)間，CK深層(>0.2～0.4和>0.4～0.6 m)土壤中抗性基因的檢出頻率和豐度顯著低于MA。研究結(jié)果提示植物根際對(duì)土壤中抗性基因的增殖及向下遷移具有一定作用。

4 結(jié)論

在玉米根際和非根際土壤中，4種大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(erms)均被檢出，且ermF相對(duì)豐度最高，ermC相對(duì)豐度最低。隨著玉米生長(zhǎng)時(shí)間的推移(7～63 d)，BK土壤中erms相對(duì)豐度呈逐漸下降趨勢(shì)，而RH土壤中erms相對(duì)豐度雖呈現(xiàn)一定波動(dòng)，但最終趨于穩(wěn)定，并高于BK土壤，提示根際對(duì)于土壤中抗性基因豐度的促進(jìn)和維持具有明顯作用。

通過(guò)對(duì)剖面土壤中抗性基因垂直分布的研究發(fā)現(xiàn)，不同抗性基因在土壤中的縱向分布差異顯著，不同土層中4種erms相對(duì)豐度由大到小依次為0～0.2、>0.2～0.4和>0.4～0.6 m。種植玉米(MA)土壤中抗性基因相對(duì)豐度顯著高于未種植玉米(CK)土壤，隨著縱向距離的加深，抗性基因的檢出頻率和豐度也相應(yīng)呈遞減趨勢(shì)。這表明植物根際的存在促進(jìn)了土壤中抗性基因豐度的增加以及在剖面土壤中的縱向遷移。

總之，植物根際的存在對(duì)抗性基因在土壤中的增殖、擴(kuò)散及縱向遷移具有一定推動(dòng)作用，這種作用可能主要與根際分泌物對(duì)土壤中細(xì)菌群落的影響有關(guān)，因此進(jìn)一步分析玉米生長(zhǎng)過(guò)程中根際與非根際土壤中細(xì)菌群落的組成變化，將為揭示植物根際對(duì)土壤中抗性基因的影響提供一定理論基礎(chǔ)。