高潔銘，楊世鵬，孫雪梅，王麗慧，李 莉，鐘啟文*

(1.青海大學(xué)，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

【研究意義】菊芋(HelianthustuberosusL.)又稱洋姜、鬼子姜，隸屬于菊科(Compositae)向日葵屬(H.annuusL.)，是一種多年生草本植物，且其塊莖中含有豐富的果聚糖[1]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)菊芋的研究主要集中在生理生化[2]、果聚糖代謝[1]、生物能源[3]、生態(tài)治理[4]和栽培技術(shù)[5]等方面。菊芋具有較強(qiáng)的抗逆性能，尤其在抗鹽堿、抗旱、抗寒等方面抗性較強(qiáng)，并且因其根系發(fā)達(dá)具有保持水土等作用，因此成為我國(guó)荒漠地區(qū)主要的防風(fēng)固沙作物之一[6]。目前，已經(jīng)被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的DNA標(biāo)記技術(shù)有20余種，由于菊芋基因組尚未開(kāi)發(fā)，因此在菊芋這種作物上應(yīng)用的DNA標(biāo)記僅4種：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)[7]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間(inter-simple sequence repeat，ISSR)[7-8]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)[9-10]和DNA標(biāo)記和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)[11-12]。其中SSR標(biāo)記不但可以檢測(cè)到多等位基因位點(diǎn)，并且基于擴(kuò)增多態(tài)性豐富，且PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便、成本較低，已成為當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的DNA分子標(biāo)記技術(shù)之一[13]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前SSR標(biāo)記已經(jīng)在國(guó)外普遍應(yīng)用于向日葵遺傳圖譜構(gòu)建和多樣性分析，如雜種優(yōu)勢(shì)利用和親緣關(guān)系分析[14-16],基于QTL定位的抗逆性育種分析[17-19]及應(yīng)用于品種的基因分型鑒定[20-21]等。但在國(guó)內(nèi)，分子標(biāo)記在菊芋種質(zhì)資源及育種方面的運(yùn)用都相對(duì)欠缺。目前對(duì)僅有的報(bào)道查閱得出，薛志忠等通過(guò)SRAP對(duì)58份種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，由于其可以充分體現(xiàn)各資源間的差異性，因此可作為一種種質(zhì)鑒定的依據(jù)[11]；趙孟良等對(duì)43份菊芋種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)外菊芋種質(zhì)資源遺傳差異性較大且與國(guó)內(nèi)資源還存在較大的遺傳距離[8]。楊世鵬等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)菊芋種植資源進(jìn)行分析得出，SSR標(biāo)記為菊芋種質(zhì)資源選擇育種、遺傳圖譜的構(gòu)建與多樣性分析等提供豐富可靠的標(biāo)記[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)本課題組前期形態(tài)學(xué)研究得出，菊芋種質(zhì)資源呈現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，但其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近及遺傳結(jié)構(gòu)仍不明確，僅僅通過(guò)表型差異和地理來(lái)源來(lái)評(píng)價(jià)效率較低且不準(zhǔn)確，必須使用更加有效地標(biāo)記方法。目前DNA標(biāo)記在分子生物學(xué)方面應(yīng)用較廣泛，主要包括種質(zhì)資源選育與研究、關(guān)鍵目標(biāo)基因定位、標(biāo)記輔助育種等方面[22]?！緮M解決的科學(xué)問(wèn)題】為有效鑒定區(qū)分不同菊芋品種，保證品種純度，更好地促進(jìn)國(guó)內(nèi)菊芋育種研究，本研究采用SSR、SRAP標(biāo)記對(duì)12份國(guó)內(nèi)品種和8份美國(guó)菊芋資源進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建和遺傳親緣關(guān)系分析，旨在為菊芋育種利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于數(shù)字化DNA指紋圖譜構(gòu)建和親緣關(guān)系分析的材料為本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)自建4份品種以及收集的8份國(guó)內(nèi)不同地區(qū)品種和8份美國(guó)菊芋資源(表1)。材料于2018年4月種于青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)田，在2018年10月菊芋塊莖成熟后收集樣品置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，以用于DNA的提取以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 稱取100 mg新鮮菊芋塊莖，迅速通過(guò)液氮冷凍并充分研磨，使用Plant Genomic DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)其進(jìn)行DNA的提取；通過(guò)1 %的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的總DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 SSR、SRAP引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室之前建立的菊芋SSR/SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，采用北京六合華大基因科技有限公司合成10對(duì)SSR、10對(duì)SRAP引物組合，對(duì)20份菊芋基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從條帶清晰度、亮度和條帶數(shù)等方面篩選出適合于SSR、SRAP遺傳多樣性研究的引物序列。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系選擇及毛細(xì)管電泳檢測(cè) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的菊芋SSR -PCR、SRAP-SSR最佳反應(yīng)體系[10-12]，對(duì)20分菊芋種質(zhì)資源進(jìn)行PCR程序擴(kuò)增。本試驗(yàn)選用25 μl的PCR反應(yīng)體系：12.5μl的2×TaqPCR MastreMix, 1 μl的模板DNA，正反引物各1 μl，ddH2O補(bǔ)充至25 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，Tm退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10 min，4 ℃保存。通過(guò)LabChip GxTouch HT儀器，HT DNA 1K Reagent Kit試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶。

表1 供試菊芋材料

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用LabChip GX Reviewer軟件分析擴(kuò)增片段峰型，讀取片段數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)分析采用Excel進(jìn)行指紋圖譜的結(jié)果統(tǒng)計(jì)，用“1”表示高位條帶，“0”表示低位條帶或無(wú)條帶；使用DPS軟件計(jì)算各種植資源間的遺傳距離，并將遺傳距離通過(guò)MEGA7.0進(jìn)行UPGMA聚類分析,最后使用iTOL(https://itol.embl.de/)對(duì)樹(shù)形圖進(jìn)行美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性條帶的篩選

通過(guò)毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)共篩選出7對(duì)片段大小介于100～600 bp、條帶清晰、多態(tài)性和穩(wěn)定性都比較好的SSR引物，8對(duì)片段大小介于100～950 bp條帶清晰、多態(tài)性和穩(wěn)定性都比較好的SRAP引物(表2)。引物1770對(duì)供試菊芋材料的擴(kuò)增片段無(wú)多態(tài)性差異，引物10897對(duì)材料的擴(kuò)增多樣性最好(圖1～2)。

最高條帶為1500 bp UPmarker(UM),最低條帶為L(zhǎng)ow Marker(LM);中間條帶為材料擴(kuò)增條帶，供試材料按照從左到右的順序依次排列The highest band is 1500 bp UPmarker(UM), the lowest band is the low marker(UM); The intermediate band is the material expansion band. The test materials are arranged in order from left to right圖1 引物1770在20份菊芋種質(zhì)資源的SSR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 SSR amplification electrophoresis map of primer 1770 in 20 parts of Jerusalem artichoke germplasm resources

最高條帶為1500 bp UPmarker(UM),最低條帶為L(zhǎng)ow Marker(LM);中間條帶為材料擴(kuò)增條帶，供試材料按照從左到右的順序依次排列The highest green band is 1500 bp UPmarker(UM), the lowest green band is the low marker(UM); The intermediate band is the material expansion band. The test materials are arranged in order from left to right圖2 引物10897在20份菊芋種質(zhì)資源的SSR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 SSR amplification electrophoresis map of primer 10897 in 20 parts of Jerusalem artichoke germplasm resources

表2 15對(duì)引物名稱及序列

續(xù)表2 Continued table 2

引物名稱Primer name正向序列F primer反向序列R primer退火溫度(℃)TmMe6-Em6TGAGTCCAAACCGGTAGGACTGCGTACGAATTGCA51.9Me9-Em14TGAGTCCAAACCGGTCAGACTGCGTACGAATTCAG51.9Me4-Em5TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTAAC51.2Me3-Em14TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTCAG50.3Me1-Em1TGAGTCCAAACCGGATATGAGTCCAAACCGGATA49.2Me3-Em2TGAGTCCAAACCGGAATTGAGTCCAAACCGGAAT50.7

圖3 部分SSR引物在20分菊芋品種中擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of some SSR primers in 20 points of Jerusalem artichoke varieties

圖4 部分SRAP引物在20分菊芋品種中擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of some SRAP primers in 20 points of Jerusalem artichoke varieties

2.2 標(biāo)記的多態(tài)性分析

利用篩選出的15對(duì)特異性引物分別對(duì)20份供試材料的基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性分析(圖3～4)。其中7對(duì)SSR引物在擴(kuò)增結(jié)果中表現(xiàn)出多態(tài)性，共擴(kuò)增出435個(gè)位點(diǎn)，具有多態(tài)性的位點(diǎn)234個(gè)，多態(tài)性比率為53.7 %，擴(kuò)增片段為200～600 bp,其中1739、ES5717為多態(tài)性較好的引物序列；8對(duì)SRAP引物共擴(kuò)增出285個(gè)位點(diǎn)，具有多態(tài)性位點(diǎn)146個(gè)，多態(tài)性比率為51.4 %。擴(kuò)增片段為400～100 bp,其中Me1-Em6表現(xiàn)出較高的特異性。

2.3 20份菊芋品種的數(shù)字化指紋圖譜的構(gòu)建

利用15對(duì)引物對(duì)20份供試材料進(jìn)行分子標(biāo)記，根據(jù)片段大小、條帶特異性選擇目的條帶。分析菊芋遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)地或選育機(jī)構(gòu)提供的菊芋品種基因組DNA間差異較小。即青芋系列、廊坊系列以及吉菊芋和定芋系列都各自相差不太明顯。20份菊芋供試材料通過(guò)2對(duì)SSR引物和4對(duì)SRAP引物(9個(gè)不同片段大小條帶)可以完全被區(qū)分開(kāi)。用1、0數(shù)字表示條帶的有無(wú)，將擴(kuò)增結(jié)果的特異性指紋圖譜轉(zhuǎn)化為數(shù)字，構(gòu)建出菊芋數(shù)字化DNA指紋圖譜(表3)，依據(jù)圖譜差異可以鑒定分析來(lái)源不同的菊芋品種。借助該圖譜可以快速鑒定和溯源不同地理來(lái)源的菊芋。

2.4 20份菊芋品種聚類分析

經(jīng)MEGA7.0軟件中UPGMA聚類方法，通過(guò)SSR和SRAP兩種分析標(biāo)記對(duì)20份待測(cè)品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)這些品種遺傳相似系數(shù)在0.83～0.91之間。并且可以將20份品種分為六大類。第一類為Ames22746;第二類為T(mén)uB1798；第三類為T(mén)uB2050、青芋1號(hào)；第四大類包括吉菊芋3號(hào)、青芋2號(hào)、廊芋8號(hào)、TuB1799、廊坊7號(hào)、TuB1777、TuB1797、Ames22745;第五大類包括定芋1號(hào)、吉菊芋2號(hào)、青芋3號(hào)、吉菊芋4號(hào);第六類包括USA、青芋4號(hào)、定芋2號(hào)、廊坊6號(hào)。根據(jù)分類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)國(guó)內(nèi)品種都聚類在一起，且來(lái)源于美國(guó)的Ames22746單獨(dú)分為一類。

對(duì)SSR結(jié)果單獨(dú)分析發(fā)現(xiàn)吉菊芋2號(hào)和青芋4號(hào)的指紋圖譜完全相同，它們的遺傳距離為0，且根據(jù)圖6a發(fā)現(xiàn)他們被聚類到一起。又對(duì)2種分子標(biāo)記結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)這2個(gè)品種仍具有一定的差異，遺傳距離為0.5892。

表3 20份菊芋資源的數(shù)字化DNA指紋圖譜

圖5 20份菊芋品種基于SSR和SRAP分析的聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of 20 Jerusalem artichoke variety based on SSR and SRAP analysis

3 討 論

利用SSR、SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)12份國(guó)內(nèi)菊芋品種與8份美國(guó)菊芋種質(zhì)資源進(jìn)行毛細(xì)管電泳，結(jié)果表明，供試材料表現(xiàn)出遺傳多樣性，中國(guó)菊芋品種與美國(guó)菊芋品種存在一定的差異性,因此菊芋品種間的遺傳分化與地理差異有一定的相關(guān)性，這與鄧吉良等[23]對(duì)海南地區(qū)甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行SSR分子標(biāo)記結(jié)果一致。其中單獨(dú)對(duì)SSR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，青芋4號(hào)與吉菊芋2號(hào)的指紋圖譜完全相同，又結(jié)合SRAP結(jié)果顯示這品種仍存在一定的差異，但差異不明顯，推測(cè)可能是引種交流導(dǎo)致基因在不同地區(qū)的滲入所[24-25]。本試驗(yàn)擴(kuò)增出的SSR、SRAP片段間遺傳距離多態(tài)性較高，各位點(diǎn)的差異及變幅較大，說(shuō)明菊芋通過(guò)長(zhǎng)期的選擇進(jìn)化，其基因組保持并形成了較高的遺傳變異，這可能與菊芋資源長(zhǎng)期的無(wú)性(塊莖)繁殖及存在自交不親和性有關(guān)[24,26]。本實(shí)驗(yàn)所選的7對(duì)SSR特異性引物并不能完全將來(lái)自不同地區(qū)的20份菊芋品種區(qū)分出來(lái)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還需注意引物設(shè)計(jì)的特異性。

圖6 20份菊芋資源基于SSR分子標(biāo)記分析的聚類分析圖Fig.6 Cluster analysis of 20 Jerusalem artichoke resources based SSR molecular marker analysis

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于菊芋的遺傳多樣性研究的DNA分子標(biāo)記方法主要是SSR、ISSR、RAPD等標(biāo)記法。其中SSR標(biāo)記是具有高分辨率的遺傳共顯性標(biāo)記[27]，通過(guò)群體之間多態(tài)性比較，可有效區(qū)分基因型之間的遺傳距離。此外，SSR分子標(biāo)記還被廣泛應(yīng)用于鑒別植物品系、遺傳多樣性分析和系譜分析中[28]。僅對(duì)青芋系列的4個(gè)品種形態(tài)學(xué)分析，紫色紡錘狀的青芋1號(hào)、淺粉色瘤狀的青芋2號(hào)、白色瘤狀的青芋3號(hào)以及粉色棒狀的青芋4號(hào)并沒(méi)有較強(qiáng)的相似性，但結(jié)合聚類分析得出青芋1號(hào)與青芋2號(hào)可以被劃分為一大類，青芋3號(hào)和青芋4號(hào)被劃分為一大類，由此可以得出相對(duì)于形態(tài)學(xué)標(biāo)記，其聚類分析圖能更客觀地反映菊芋種質(zhì)資源之間的遺傳關(guān)系，這與張道微等對(duì)甘薯種質(zhì)資源花青素積累的遺傳多態(tài)性分析結(jié)果一致[29]。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)毛細(xì)管電泳，利用SSR、SRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了8份菊芋品種和12份種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜。通過(guò)聚類結(jié)果分析其親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)，20份種質(zhì)資源的分子標(biāo)記結(jié)果基本反映了各品種間的親緣關(guān)系。為菊芋的雜交保護(hù)工作提供了分子標(biāo)記保護(hù)策略的參考依據(jù)，也可為雜優(yōu)育種中親本選配提供理論依據(jù)，并且SSR、SRAP 標(biāo)記用于菊芋近似品種輔助選擇是可行的。