陳 奇，周水娟，孫康泰，劉 靜，袁寶童，王議萍，王 為，王有武，汪保華，莊智敏*

(1.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通 226019；2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002；3.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

【研究意義】棉花是世界上首選的也是最重要的紡織纖維原材料，其產(chǎn)量的提高對推動世界經(jīng)濟(jì)和紡織工業(yè)的發(fā)展起著重要作用，進(jìn)而可有力地改善了人民生活水平。籽棉產(chǎn)量和皮棉產(chǎn)量是棉花產(chǎn)量的兩種主要衡量指標(biāo)，而單株鈴數(shù)、單鈴重、衣分則是皮棉產(chǎn)量的三個主要組成要素，其中衣分在產(chǎn)量育種的選擇中占據(jù)重要地位[1]，在各因素中具有最高的遺傳率[2]。因此，定位棉花中衣分相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)，可對棉花的產(chǎn)量研究做出貢獻(xiàn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，分子標(biāo)記輔助育種(Molecular Marker Assisted Selection，MAS)技術(shù)不斷發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于各種種質(zhì)研究中，并將發(fā)揮出越來越大的作用[3]。SSR分子標(biāo)記是最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一，而且它已經(jīng)被用于棉花育種許多年，并取得了許多成果，通過構(gòu)建相關(guān)遺傳圖譜，在DNA水平上對相應(yīng)數(shù)量性狀基因座(Quantitative Trait Locus, QTL)的數(shù)目、位置、效應(yīng)以及QTL與QTL間、QTL與環(huán)境的互作、QTL的一因多效性等展開研究，結(jié)合表型性狀能直觀反應(yīng)作物的遺傳多樣性[4]。導(dǎo)入系(Introgression lines，ILs)，又稱染色體片段代換系(Chromosome segments substitution lines)，可簡要理解為用供體親本的染色體片段去替換受體親本的相應(yīng)位置片段[5]，該過程可通過自交和回交相結(jié)合的方式來構(gòu)建目的群體。染色體片段導(dǎo)入系可以定向改良棉花產(chǎn)量性狀，其關(guān)鍵在于能對復(fù)雜的產(chǎn)量性狀進(jìn)行定位。迄今為止，研究者已在包括水稻、玉米、番茄、油菜等一些作物的染色體片段導(dǎo)入系中進(jìn)行過QTL詳細(xì)定位研究[6-10]。而所謂的QTL定位，就是定位基因在染色體上的位置。為了棉花的基因組研究和分子育種，早在十多年前，國外就已經(jīng)開展了QTL定位在棉花育種中的研究，許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)繪制過產(chǎn)量和產(chǎn)量構(gòu)成因子性狀的QTL[11]。石玉真等[12]利用主效纖維QTL的分子標(biāo)記輔助選擇明顯地改善了棉花纖維強(qiáng)度，加快了棉花纖維品質(zhì)的育種進(jìn)程。然而，他們使用的絕大多數(shù)分離群體是暫時性群體，由于低遺傳性和高實(shí)驗(yàn)誤差是影響數(shù)量性狀鑒定的主要因素，構(gòu)建永久性的群體來解決這些問題是一種有效的方法。重組自交系(RILs)群體以及導(dǎo)入系群永久性群體在植物育種和遺傳研究中非常有用[13-14]。【本研究切入點(diǎn)】四倍體棉花栽培種主要有2個：陸地棉(GossypiumhirsutumL.)以及海島棉(GossypiumbarbadenseL.)，其中陸地棉是更為廣泛的栽培棉[15-16]。黃褐棉是起源于巴西的四倍體野生棉，與陸地棉遺傳距離相距甚遠(yuǎn)，必然具備一些新的有用的基因位點(diǎn)，若能將其導(dǎo)入到陸地棉中，可能會對栽培品種的改良有重要意義。Tanksley和Nelson提出的回交高世代QTL(Advanced backcross QTL，AB-QTL)分析法可將野生種的優(yōu)良主效基因?qū)氲匠Ｒ?guī)栽培種中，并能很好地解決在引入有利基因時產(chǎn)生的連鎖累贅問題[17]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬利用野生棉資源來拓寬陸地棉遺傳多樣性，以黃褐棉與陸地棉雜交并回交構(gòu)建的導(dǎo)入系群體為材料，開展SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，結(jié)合衣分表型性狀調(diào)查，鑒定衣分QTL，以期服務(wù)于后續(xù)的棉花分子育種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以常規(guī)栽培棉陸地棉PD94042為受體親本(P1)，以野生棉黃褐棉(G.mustelinum)為供體親本(P2)雜交，雜交后代與陸地棉輪回親本回交，通過多次回交構(gòu)建出高世代回交群體[18]。從中選育出一套滲透有黃褐棉染色體片段的導(dǎo)入系群體(共計65份材料)并置于2個環(huán)境(2011與2012年)下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本次研究中的棉花葉片DNA的提取采用CTAB法[19]，并根據(jù)具體情況作了相應(yīng)的改良，提取后的DNA采用1 %的瓊脂糖電泳檢測其濃度及分子量，或者使用紫外分光光度計檢測DNA的純度與濃度，OD260/OD280值在1.7～1.9 范圍內(nèi)為合適。SSR分子標(biāo)記包括PCR反應(yīng)體系的建立和擴(kuò)增、產(chǎn)物的分離、基因型的分析等步驟。實(shí)驗(yàn)過程中標(biāo)記出并記錄所得數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

實(shí)驗(yàn)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來進(jìn)行群體基因型統(tǒng)計，根據(jù)清楚的顯示條帶結(jié)果，然后依據(jù)DNA Ladder標(biāo)準(zhǔn)，記錄所用SSR標(biāo)記的類型，將每個引物所標(biāo)記的數(shù)據(jù)輸入Excel表格。在整個實(shí)驗(yàn)過程中仔細(xì)記錄各個時間段的田間表型數(shù)據(jù)，輸入Excel表格，并進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計分析，計算其衣分相關(guān)值，包括平均值、范圍、變異系數(shù)、偏度等，并制作柱狀分布圖。

綜合導(dǎo)入系群體的基因型數(shù)據(jù)，用MAPMAKER/EXP 3.0軟件分析各標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系，選用Kosambi函數(shù)，LOD值設(shè)為3，最大交換距離為40 cM，構(gòu)建分子標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜；結(jié)合田間表型數(shù)據(jù)，利用WinQTLCart2.5軟件開展基于黃褐棉導(dǎo)入系的衣分QTL定位，檢測QTL最低LOD值為3。

2 結(jié)果與分析

2.1 衣分表型分析

如表1所示，2011年的衣分(LP11)平均值為34.88，親本衣分小于群體平均值；導(dǎo)入系群體的衣分變化范圍是17.58～41.60，數(shù)據(jù)變異程度不是很高，但偏度絕對值較高。2012年的衣分(LP12)平均值為36.23，親本衣分大于群體平均值；導(dǎo)入系群體的衣分變化范圍是18.98～41.81，數(shù)據(jù)變異程度較大，偏度絕對值較高。

表1 黃褐棉導(dǎo)入系群體衣分統(tǒng)計分析

圖1 導(dǎo)入系群體衣分表型分布Fig.1 Phenotypic distribution of lint percentage in the IL population

導(dǎo)入系群體的衣分分布如圖1所示，根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計可以看出該導(dǎo)入系群體中存在來自于黃褐棉的與衣分相關(guān)的漸滲片段，對群體衣分的提高具有一定的促進(jìn)作用。

2.2 遺傳連鎖圖與衣分QTL分析

綜合導(dǎo)入系群體的表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)，構(gòu)建衣分性狀的遺傳連鎖圖譜。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合區(qū)間作圖，檢測某一特定的標(biāo)記區(qū)間，將該特定標(biāo)記與其他QTL連鎖的標(biāo)記也擬合在模型中，控制背景遺傳效應(yīng)[20]。

由表2可以看出，共檢測到21個衣分QTLs，它們的LOD值均大于3；解釋的表型方差從19.3 %(qLP-2-1)到42 %(qLP-19-1)。根據(jù)加性效應(yīng)可知，共有9個QTL，即qLP-2-1、qLP-3-1、qLP-5-1、qLP-11-2、qLP-19-1、qLP-19-2、qLP-22-1、qLP-23-1、qLP-26-1的衣分增效基因來自于黃褐棉。位于3號染色體上的qLP-3-1在兩個環(huán)境下都能檢測到；5號染色體上的qLP-5-1、11號染色體上的qLP-11-2以及位于19號染色體上的qLP-19-1，它們的LOD值大于7；這4個QTL的衣分增效基因均來自黃褐棉，即黃褐棉具有提高衣分的作用，有必要進(jìn)一步開展深入研究，可以作為后續(xù)精細(xì)定位以及優(yōu)良導(dǎo)入系選擇基礎(chǔ)的重點(diǎn)內(nèi)容。

表2 導(dǎo)入系群體衣分QTL定位結(jié)果

3 討 論

作物的大部分農(nóng)藝性狀由多基因控制，但每個基因只能表現(xiàn)出微效的作用，而且環(huán)境對作物表型的影響相對較大，因此用傳統(tǒng)的育種方法進(jìn)行性狀選擇會造成較大的偏差。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳圖譜構(gòu)建中的廣泛應(yīng)用，許多研究者提出利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法來改良數(shù)量性狀，比利時人Peleman和vander Voort[21]在2003年提出構(gòu)建大量的染色體片段導(dǎo)入系的分子設(shè)計新型育種方法，極大地推動了分子育種的進(jìn)程。Kohel早在1977年就利用陸地棉TM-1、海島棉3-79雜交，培育了6個單片段代換系材料[22]。在作物中也報道了通過分子標(biāo)記輔助選擇和高世代回交相結(jié)合的方法來獲得染色體漸滲片段，包括棉花[23]、大豆[24]、水稻[25]等。在前人的眾多研究中，極少有使用黃褐棉染色體片段漸滲系的報道，本研究使用野生棉黃褐棉作為親本材料之一，黃褐棉作為與陸地棉遺傳距離最遠(yuǎn)的異源四倍體野生棉，很可能具備一些優(yōu)異的基因位點(diǎn)，如能將其導(dǎo)入到栽培種陸地棉中，可對改良現(xiàn)有陸地棉栽培種做出重大貢獻(xiàn)。

衣分是棉花產(chǎn)量的重要組分之一，在陸地棉眾多的產(chǎn)量構(gòu)成因子中具有最高的遺傳率，許多研究者都已做過大量研究。張建[26]等利用陸海重組自交系群體，共鑒定到12個影響衣分的QTL，解釋表型變異率為3.5 %～21.2 %。Guo等[27]利用陸地棉的重組自交系群體檢測到6個衣分相關(guān)的QTL。Li等[28]利用陸地棉組合F2:3群體檢測到1個衣分相關(guān)的QTL?？讖V超[29]等利用永久性陸地棉RIL群體在4種環(huán)境下共檢測到6個與衣分相關(guān)的、具有較高貢獻(xiàn)率的QTL。

本研究以黃褐棉染色體片段替換系為材料，在2011和2012兩個不同環(huán)境中，共鑒定到21個影響衣分的QTL，它們大多離散地分布在多條染色體上，解釋表型變異率為19.3 %～42 %，加性效應(yīng)在4.75～6.40。同一性狀的QTL在不同定位群體中的表現(xiàn)不一致，同一群體的QTL檢測結(jié)果也會因環(huán)境等因素的不同而有差異；位于3號染色體上的QTLqLP-3-1在兩個環(huán)境中均檢測到，表現(xiàn)出不依賴于環(huán)境的穩(wěn)定性。位于19號染色體上的qLP-19-1貢獻(xiàn)率高且LOD值最大，可以作為后續(xù)研究的重點(diǎn)內(nèi)容，開展精細(xì)定位甚至圖位克隆。朱亞娟[30]等利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系鑒定到位于15號染色體上的QTL，與所檢測到的qLP-15-1可能具有一定的關(guān)聯(lián)；同時，位于3號染色體上的QTLqLP-3-1與25號染色體上的qLP-25-1可能與Guo[29]等在同一條染色體上檢測到的衣分QTL通過共性標(biāo)記建立聯(lián)系；Zhang[31]等利用基于陸地棉的重組自交系群體鑒定到位于5號染色體上的qLP-5-1和18號染色體上qLP-18-1，本研究中也有相應(yīng)染色體的QTL。

4 結(jié) 論

本研究鑒定出的衣分 QTLs 大多都具有較高的貢獻(xiàn)率，在棉花產(chǎn)量的分子設(shè)計育種方面具有一定的應(yīng)用前景。在接下來的研究中，可以用含有貢獻(xiàn)率較大QTL的導(dǎo)入系材料為供體親本，與陸地棉品種進(jìn)行雜交與回交，開展精細(xì)定位，加快棉花產(chǎn)量的分子育種進(jìn)程。