董環(huán)　張曉梅　孟麗紅　顧瀟楓　于小林　劉彧杉　閆宏

摘要：目的??觀察肺纖方對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠wnt3a、β-catenin、WIF1、LRP表達(dá)的影響，探討其抗肺纖維化的作用機(jī)制。方法 ?采用氣管插管滴注博來霉素制作肺纖維化大鼠模型。將120只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、潑尼松組和肺纖方高、中、低劑量組，造模次日給予相應(yīng)藥物灌胃。于造模后第14、28日分2批進(jìn)行動物處理，Western blot檢測wnt3a、β-catenin、WIF1的蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測LRP 的mRNA表達(dá)。結(jié)果 ?與假手術(shù)組比較，第14、28日模型組大鼠肺組織wnt3a、β-catenin、LRP表達(dá)均顯著升高（P<0.05，P<0.01），第28日WIF1表達(dá)顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，肺纖方中劑量組第14、28日大鼠肺組織wnt3a、β-catenin、LRP表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），WIF1表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 ?肺纖方具有抗肺纖維化的作用，其機(jī)制可能與抑制模型大鼠wnt3a、β-catenin、LRP的過表達(dá)和增加WIF1的低表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肺纖方;博來霉素;肺纖維化;Wnt/β-catenin信號通路;大鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）09-0060-05

Effects of Feixian?Formula on Expressions of wnt3a， β-catenin， WIF1 and LRP in Bleomycin-induced Pulmonary Interstitial Fibrosis in Rats

DONG Huan¹， ZHANG Xiaomei²， MENG Lihong¹， GU Xiaofeng¹， YU Xiaolin¹， LIU?Yushan¹， YAN Hong¹

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2.?Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective?To investigate the effects of Feixian?Formula on the expressions of wnt3a， β-catenin， WIF1 and LRP in bleomycin （BLM）?-induced pulmonary fibrosis in rats; To explore its anti-pulmonary fibrosis mechanism. Methods Intravenous intubation of BLM?was used to establish pulmonary fibrosis rat models. 120 Wistar rats were randomly divided into sham-operation group， model group， Prednisone group， and Feixian?Formula high-， medium- and low-dosage groups. The day after model establishing， gavage was intervened with corresponding medicine. Animals were treated in two batches on the 14th and 28th day after?modeling. The protein expressions of wnt3a， β-catenin and WIF1 were detected by Western blot， and the mRNA expression of LRP was detected by RT-PCR. Results Compared with sham-operation group， the expressions of wnt3a， β-catenin and LRP in lung tissue of rats in model group increased significantly on day 14 and day 28 （P<0.05，?P<0.01）， and the expression of WIF1 decreased significantly on day 28 （P<0.05）.?Compared with model group， the expressions of wnt3a， β-catenin and LRP in lung tissue of rats in Feixian?Formula medium-dosage group decreased significantly on day 14 and day 28 （P<0.05.?P<0.01）， and the expression of WIF1 increased significantly （P<0.05，?P<0.01）. Conclusion?Feixian?Formula has anti-pulmonary fibrosis effects， and the mechanism may be related to inhibiting the overexpression of wnt3a， β-catenin and LRP in rats with pulmonary fibrosis and increasing the low expression of WIF1.

Keywords：FeixianFormula; bleomycin; pulmonary interstitial fibrosis; Wnt/β-catenin pathway; rats

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是指慢性、進(jìn)行性、原因不明的肺間質(zhì)性纖維化病變，其發(fā)病率為10～15人/10萬人，呈明顯增長趨勢，缺乏有效的治療手段、預(yù)后差^[1-3]。迄今多項研究表明，Wnt/β-catenin信號通路對組織系統(tǒng)的生理、病理起著至關(guān)重要的作用，包括胚胎形成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、血管生成及癌癥形成等^[4-5]。Wnt/β-catenin信號通路的激活參與多種組織器官的纖維化形成過程^[6-8]。北京中醫(yī)藥大學(xué)姜良鐸教授依據(jù)多年治療肺纖維化的臨床經(jīng)驗，根據(jù)其肺腎兩虛、痰瘀痹阻肺絡(luò)的基本病機(jī)特點(diǎn)，提出補(bǔ)肺益腎、滌痰化瘀、搜剔肺絡(luò)的治療方法，并總結(jié)出治療肺纖維化的效方肺纖方^[9-10]。本實(shí)驗通過檢測肺纖方對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠Wnt/β-catenin信號通路wnt3a、β-catenin、WIF1和LRP表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 ?實(shí)驗材料

1.1 ?動物

清潔級雄性Wistar大鼠120只，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華動物公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗中心清潔級動物房。

1.2 ?藥物

肺纖方（黃芪15 g，紅景天15 g，冬蟲夏草3 g，炙麻黃6 g，水蛭5 g，白果10 g，瓜蔞20 g，甘遂2 g，海蛤殼30 g），飲片由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房提供，常規(guī)煎制，按每100 g體質(zhì)量給藥1 mL的標(biāo)準(zhǔn)制備藥液。注射用博來霉素，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，15 mg/支，批號16037911;醋酸潑尼松片，天津力生制藥股份有限公司，5 mg/片，批號1703035。

1.3 ?主要試劑與儀器

TRNzol總RNA提取試劑，天根生化科技有限公司，批號DP405-02;RIPA總蛋白提取試劑盒，美國Sigma公司，批號Cat No.R0278;PMSF，美國Sigma公司，批號Cat No. PMSF-RO;GAPDH鼠單抗，天津銳爾康生物科技有限公司，批號Cat No.REK0005;抗wnt3a 抗體，美國Thermo公司，批號Cat PA5-44946;抗β-catenin 抗體，美國CST公司，批號Cat 8480;抗WIF1抗體，美國Abcam公司，批號Cat ab155101;ECL，德國Millipore公司，批號Cat No.WBKLS0500。超聲粉碎機(jī)（浙江三門超聲波儀器廠），全自動顯微攝像系統(tǒng)（日本Olympus公司），渦旋振蕩儀（型號QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），離心機(jī)（美國Eppendorf公司），分光光度計、酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Thermo公司），凝膠成像系統(tǒng)（型號Tanon 1600，上海天能科技有限公司），熒光定量PCR儀（型號ABI7500，Applied Biosystems）。

2 ?實(shí)驗方法

2.1 ?分組

實(shí)驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、潑尼松組和肺纖方高、中、低劑量組，每組20只。

2.2 ?造模

采用博來霉素氣管插管復(fù)制肺纖維化模型^[11-12]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg體質(zhì)量）麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，經(jīng)氣管插入18號大鼠導(dǎo)管。假手術(shù)組一次性氣管內(nèi)注入生理鹽水1 mL/kg體質(zhì)量，其余組以3 mg/kg注入博來霉素，隨即注入空氣0.3 mL，完畢后立即將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)，清醒后正常攝食飲水。

2.3 ?給藥

大鼠造模次日開始常規(guī)灌胃給藥，每日1次。按1 mL/100 g體質(zhì)量給藥標(biāo)準(zhǔn)配制藥液。肺纖方高、中、低劑量組給藥劑量依次為19.8、9.9、4.95 g/kg體質(zhì)量，分別為成人臨床用藥的2、1、0.5倍，每周稱重，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量;潑尼松組給予潑尼松藥液4.2 mg/kg;模型組和假手術(shù)組給予等體積生理鹽水。給藥至取材前1 d。

2.4 ?取材

于造模后第14、28日，隨機(jī)分2批1%戊巴比妥麻醉，將大鼠仰臥固定，取出肺臟，迅速放入-80 ℃冰箱冰凍，用于Western blot檢測蛋白表達(dá)和RT-PCR 檢測mRNA表達(dá)。

2.5 ?檢測指標(biāo)

2.5.1 ?wnt3a、β-catenin、WIF1蛋白表達(dá)檢測

取大鼠肺組織100 mg，裂解，離心，收集上清液，提取組織總蛋白。待檢測蛋白樣品上樣10 μg/孔;蛋白電泳;轉(zhuǎn)膜至0.45 μm孔徑的NC膜，轉(zhuǎn)膜1 h;封閉;抗體孵育;洗膜;使用ECL發(fā)光試劑盒檢測肺組織 wnt3a、β-catenin、WIF1的蛋白表達(dá)。其中wnt3a稀釋比例為1∶1000，β-catenin稀釋比例為1∶1000，WIF1稀釋比例為1∶2000，GAPDH稀釋比例為1∶10 000。使用Image J軟件對目的條帶行灰度分析，計算目的蛋白相對表達(dá)量（目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值）。

2.5.2 ?LRP mRNA表達(dá)檢測

用TRNzol總RNA提取試劑，采用Prime Script^TMRTreagent Kitwithg DNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行RT-PCR。GAPDH作為內(nèi)參，上游引物序列5'CCTTCCGTGTTCCTACCCC3'，下游引物序列5'GCCCAGGATGCCCTTTAGTG3'，產(chǎn)物長度為131?bp;LRP上游引物序列5'CAAGGAACAAGA CCCGAGTGG3'，下游引物序列5'CCCGGCAGA AAGGGACAATA'，產(chǎn)物長度為158 bp。反應(yīng)體系：2×Master Mix 10 μL，10 μmol/L PCR特異引物F?0.5 μL，10 μmol/L PCR特異引物R 0.5 μL，加水至總體積為18 μL，將18 μL混合液加到PCR板對應(yīng)的每個孔中，再加入對應(yīng)的2 μL cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s;40個循環(huán)（95 ℃，5 s;60 ℃，40 s），擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，并從60 ℃緩慢加熱至99 ℃，建立PCR產(chǎn)物相關(guān)熔解曲線，每個樣品重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用2^ΔΔCt法進(jìn)行分析。

3 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，多組間比較，數(shù)據(jù)正態(tài)且方差齊時用方差分析，數(shù)據(jù)非正態(tài)和/或方差不齊時進(jìn)行非參數(shù)檢驗，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?肺纖方對模型大鼠肺組織wnt3a、β-catenin和WIF1蛋白表達(dá)的影響

第14日，模型組大鼠肺組織wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），WIF1蛋白表達(dá)變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)均降低，WIF1蛋白表達(dá)均升高，肺纖方中劑量組變化最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與潑尼松組比較，肺纖方中劑量組大鼠肺組織wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。第28日，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)明顯升高，WIF1蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，肺纖方各劑量組大鼠肺組織wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)降低，WIF1蛋白表達(dá)均升高，其中肺纖方中劑量組變化最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與潑尼松組比較，肺纖方中劑量組大鼠肺組織wnt3a蛋白表達(dá)明顯降低，WIF1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見圖1～圖4。

4.2 ?肺纖方對模型大鼠肺組織LRP mRNA表達(dá)的影響

第14日時，模型組大鼠肺組織LRP mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織LRP mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與潑尼松組比較，肺纖方中劑量組大鼠肺組織LRP mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。第28日時，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織LRP mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織LRP mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與潑尼松組比較，肺纖方高、中劑量組大鼠肺組織LRP mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖5。

5 ?討論

IPF是慢性、進(jìn)行性和病因不明的間質(zhì)性肺疾病，治療效果欠佳。目前尚無特異性的治療藥物，糖皮質(zhì)激素主要用于肺纖維化急性加重期;吡非尼酮和尼達(dá)尼布已被批準(zhǔn)用于治療肺纖維化，雖然可改善癥狀和減緩疾病進(jìn)展，但因藥物的高價格和不良反應(yīng)，且不能完全有效降低IPF的死亡率，故其應(yīng)用也受到限制^[3]。Wnt/β-catenin信號通路的激活與很多器官的纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有可能成為治療肺間質(zhì)纖維化等疾病的新靶點(diǎn)。Wnt/β-catenin信號通路中Wnt配體包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10、Wnt10b，其中Wnt3a是Wnt經(jīng)典途徑的代表蛋白。Wnt/β-catenin信號通路通過胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin實(shí)現(xiàn)調(diào)控過程，β-catenin也是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的重要標(biāo)志蛋白，稱為間質(zhì)標(biāo)記蛋白，Wnt活化是激活β-catenin游離的直接因素，可直接促進(jìn)EMT，而EMT又是引發(fā)肺纖維化的關(guān)鍵^[13]。

WIF1為Wnt分子的抑制劑，它可直接與Wnt分子結(jié)合，抑制Wnt分子和受體細(xì)胞膜上Frizzle受體及輔助受體LRP5/6形成三聚體復(fù)合物，使細(xì)胞中β-catenin磷酸化導(dǎo)致不能積累，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號通路活化;WIF1表達(dá)水平降低會導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，從而促進(jìn)肺纖維化^[14]。故本實(shí)驗研究重點(diǎn)為肺纖方對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)分子表達(dá)的影響。

肺纖方中黃芪補(bǔ)脾肺之氣，紅景天性寒補(bǔ)氣清肺活血，冬蟲夏草補(bǔ)腎益肺，三藥共奏補(bǔ)氣之功而無助火之力;炙麻黃宣肺氣，白果斂肺氣，二藥散斂相用，加強(qiáng)宣肺止喘之功;瓜蔞清熱化痰，海蛤殼清肺化痰，少量甘遂瀉水逐飲，三藥合用，加強(qiáng)清肺熱、化稠痰之功;水蛭破血逐瘀通絡(luò)。諸藥配伍，共奏補(bǔ)益肺腎、活血化痰功效。

本實(shí)驗結(jié)果顯示，第14、28日，模型組大鼠肺組織wnt3a、β-catenin、LRP呈高表達(dá)，WIF1呈低表達(dá)。表明肺組織中存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，且隨著肺纖維化的形成，Wnt/β-catenin信號通路活化程度更為明顯。其中WIF1第14日模型組與假手術(shù)組無顯著差異，第28日顯著降低，可能WIF1主要作用于肺纖維化時期，而炎癥時期對其表達(dá)無明顯影響;潑尼松組治療后wnt3a、β-catenin、WIF1的蛋白表達(dá)與模型組比較未見顯著差異，而LRP mRNA表達(dá)與模型組比較顯著降低，提示潑尼松組可能主要作用于LRP受體;肺纖方各劑量組wnt3a、β-catenin、LRP表達(dá)均較模型組水平低，WIF1表達(dá)均較模型組水平高，其中以肺纖方中劑量組最為明顯，提示肺纖方作用優(yōu)于潑尼松，其效應(yīng)機(jī)制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會間質(zhì)性肺疾病學(xué)組.特發(fā)性肺纖維化診斷和治療中國專家共識[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2016，39（6）：427-432.

[2] LUPPI F， SPAGNOLO P， CERRI S， et al. The big clinical trials in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Curr Opin Pulm Med，2012， 18（5）：428-432.

[3] RAGHU G， ROCHWERG B， ZHANG Y， et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline： Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis. An update of the 2011 clinical practice guideline[J]. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine，2015， 192（2）：e3-19.

[4] QU B， LIU B?R， DU Y?J， et al. Wnt/β-catenin signaling pathway may regulate the expression of angiogenic growth factors in hepatocellular carcinoma[J].?Oncol Lett，2014，7（4）：1175-1178.

[5] AANSTAS J?N， MOON R?T. WNT signalling pathways as therapeutic targets in cancer[J]. Nat Rev Cancer，2012，13（1）：11-26.

[6] YANG Y， CHEN X?X， LI W?X，?et al.?EZH2-mediated repression of Dkk1 promotes hepatic stellate cell activation and hepatic fibrosis[J].?J Cell Mol Med，2017，21（10）：2317-2328.

[7] 陳華，龔藝，周寶尚，等.MiR-200a抑制 Wnt/β-catenin信號通路緩解腎間質(zhì)纖維化[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2017，22（4）：381-386.

[8] 李嬌，趙信科，魏惠平，等.Wnt信號通路與心肌纖維化的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2017，33（18）：1828-1831.

[9] 張曉梅，姜良鐸，張偉，等.肺纖方抗大鼠肺纖維化的實(shí)驗研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（6）：407-409.

[10] 王紫娟，張宇婷，顧瀟楓，等.肺纖方加減治療36例特發(fā)性肺纖維化患者CT積分改變及生活質(zhì)量影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（8）：3682- 3685.

[11] 于小林，張曉梅，張艷霞，等.肺纖維化動物模型研究近況[J].河南中醫(yī)，2017，37（11）：1926-1928.

[12] LIU T， DE LOS SANTOS F?G， PHAN S?H.?The Bleomycin model of pulmonary fibrosis[J].?Methods Mol Biol，2017，1627：27-42.

[13] KIM T?H， KIM S?H， SEO J?Y， et al. Blockade of the Wnt/β-catenin pathway attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J]. Tohoku Journal of Experimental Medicine，2011，223（1）：45.

[14] 劉茗心，陳菊屏.Wnt信號通路與肺纖維化的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2016，32（1）：83-85.