李東芹

液質(zhì)聯(lián)用法測定蔬菜和水果中的煙酰胺單核苷酸

李東芹

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

建立B-煙酰胺單核苷酸的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定方法。采用Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為甲醇與0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫12 min，流速為0.3 mL/min,在質(zhì)譜正離子模式下用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式進(jìn)行定量測定。在0.1425-228 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好（=0.9998），回收率為86.6%~108%，RSD為3.4%；重現(xiàn)性好，RSD為2.22%；方法的定量限0.1425 μg/L（/為10），檢出限為0.07 μg/L（/為5）。該方法靈敏度高、選擇性好，適用于蔬菜、水果營養(yǎng)價(jià)值分析及藥用價(jià)值開發(fā)研究中B-煙酰胺單核苷酸的快速測定。

煙酰胺單核苷酸；西蘭花；卷心菜；牛油果；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

煙酰胺單核苷酸（NMN）是人體內(nèi)一種內(nèi)源性物質(zhì)，由煙酰胺在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的催化下生成，隨后NMN又在煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的催化下生成NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）。NMN在人體內(nèi)的生理作用都是通過轉(zhuǎn)化為NAD+完成[1]。已有的科學(xué)研究表明，NMN可以改善缺血性腦損傷[2]和阿爾茨海默癥[3]，對(duì)帕金森病[4]、退行性疾病[5-6]和肥胖[7]具有治療作用，還可減輕心肌缺血再灌注損傷[8]及腦出血腦梗出血損傷[9]等；近期研究最熱的是NMN在延緩衰老[10]、醫(yī)藥保健品方面的開發(fā)應(yīng)用。美國科學(xué)家David Sinclair博士已經(jīng)在小鼠身上證實(shí)了NMN具有逆轉(zhuǎn)生理老化的作用[11-12]，但應(yīng)用于人體尚在研究中。除了含NMN活性成分的藥品和保健品外，天然食物如蔬菜、水果、肉類[13]和哺乳動(dòng)物的乳液中[14]也發(fā)現(xiàn)NMN。質(zhì)譜定量具有靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)，可以有效降低基質(zhì)干擾帶來的測定誤差。鑒于NMN諸多的保健治療作用，測定蔬菜、水果中NMN的含量具有重要的實(shí)用價(jià)值和意義，它不僅可為蔬菜、水果營養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值研究提供NMN的快速定量方法，還可為人們膳食營養(yǎng)搭配及病人的食療保健提供理論指導(dǎo)。

1 儀器、試劑與材料

儀器：4000Qtrap串聯(lián)三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司），LC-20AD高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），Milli-pore超純水儀（美國Millipore公司），超聲波（寧波新芝），萬分之一天平（梅特勒公司），蠕動(dòng)泵（Hamilton公司）。

試劑：甲醇（色譜純，默克公司），超純水，Beta-煙酰胺單核苷酸（≥98%，LC_MS級(jí)別，醫(yī)恩醫(yī)療系統(tǒng)研發(fā)（上海）有限公司生產(chǎn)），乙酸（色譜純），1 mL醫(yī)用注射器，0.22 μm微孔濾頭（上海安普）。

材料：牛油果、西蘭花、卷心菜均在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)市場采購。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

將牛油果、西蘭花、卷心菜切成小塊，精確稱取3.5 g左右（每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)），加入5 mL、50%的甲醇水溶液，超聲萃取30 min，用1 mL醫(yī)用注射器取上清，經(jīng)0.22 μm過濾頭過濾后立即上機(jī)測試。

2.2 儀器條件

色譜條件：島津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0，5 μm）色譜柱，樣品室為室溫；流動(dòng)相：A為0.1%的乙酸水溶液，B為含2 mmol/L醋酸銨的甲醇溶液；流速為0.3 mL/min，柱溫箱溫度為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。梯度洗脫條件：0 min B與A體積比為5∶95，3 min B與A體積比為35∶65，5 min B與A體積比為100∶0，8.1 min B與A體積比為5∶95，12 min程序結(jié)束。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧（ESI）離子源，在正離子電離模式下選用多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）掃描模式進(jìn)行定量分析。電噴霧電壓5500 V，離子源溫度為500 ℃，離子源輔助氣GS1/GS2氣流均為50 L/h。

3 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

用蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣，對(duì)228 μg/L的NMN標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行Q1掃描分析。在ESI+電離模式下得到NMN的母離子為335.0[M+H]+，ESI–電離模式下得到NMN的母離子為333.2[M–H]–，陽離子模式下離子信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于陰離子，因此選用ESI+電離模式；再選用子離子掃描模式，一定碰撞能量下將母離子打碎，得到NMN的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子（圖1）；繼續(xù)對(duì)解簇電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口電壓（CXP）等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在DP為53 V、EP為8 V、CE為18 V、CXP為10 V條件下，NMN的母離子、子離子信號(hào)強(qiáng)度比例適中，靈敏度最高。選取豐度最大的子離子123.0與母離子組成對(duì)組多反應(yīng)監(jiān)測MRM離子（335.0/123.0），在優(yōu)化的參數(shù)條件下進(jìn)行定量分析。

圖1 NMN的二級(jí)質(zhì)譜碎片圖

3.2 色譜分離條件優(yōu)化

用質(zhì)量濃度為28.5 μg/L的NMN標(biāo)準(zhǔn)溶液和島津Shim-pack VP-ODS色譜柱來優(yōu)化洗脫程序及試劑。其他條件相同時(shí)20%甲醇水等度洗脫是20%乙腈水信號(hào)的2~3倍，因此選用甲醇水組合洗脫；對(duì)比20%甲醇水等度洗脫和12 min梯度洗脫，梯度洗脫分離效果更好，色譜圖中可以區(qū)分出同分異構(gòu)體（圖2）。

圖2 色譜圖

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

精確稱取3.5 g卷心菜10份，分別加入5 mL超純水、20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇（2個(gè)重復(fù)），分別在15、30、45、60、75 min取50 μL上清進(jìn)樣分析（進(jìn)樣兩次）。結(jié)果表明：每種試劑都是在0~30 min區(qū)間NMN含量逐漸升高，45 min后有不同程度的下降，60 min后含量基本保持穩(wěn)定；其中在0%~50%甲醇含量區(qū)間，隨甲醇含量升高同一時(shí)間NMN萃取效率逐漸升高；甲醇含量超過50%以后，萃取效率沒有明顯提升；30 min以后NMN含量因降解開始下降，萃取試劑含水量越高NMN降解速度越快，甲醇含量越高降解曲線越平穩(wěn)；但是甲醇含量越高，基質(zhì)干擾越嚴(yán)重，因此綜合考慮選用50%甲醇水溶液超聲萃取30 min的前處理方法。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及方法的檢出限、定量限

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精確稱取NMN標(biāo)準(zhǔn)品0.0285 g，用超純水溶解后定容至50 mL容量瓶，得到570 mg/L的NMN標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用超純水逐步稀釋成228、114、57、28.5、14.25 μg/L濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在2.2節(jié)中的儀器條件下上機(jī)分析。以標(biāo)準(zhǔn)溶液NMN的濃度為橫坐標(biāo)，NMN的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程=21 200–23 800（=0.9998），在0.143~228 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖3）。

將14.25 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)稀釋后上機(jī)分析，以目標(biāo)峰信噪比/=10確定方法的定量限為0.1425 μg/L，以/=5確定方法的檢出限為0.07 μg/L。

圖3 NMN的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

28.5 μg/LNMN標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果平均值為28.24 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%。

3.4.3 回收率

因?yàn)镹MN在處理過程中有不同程度的降解，所以加樣回收不可行，只能用空白添加計(jì)算回收率。因樣品中待測物質(zhì)量濃度在10~30 μg/L范圍，所以選擇12.5、25、50 μg/L添加。經(jīng)計(jì)算NMN的回收率為86.6%~108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%。

3.5 實(shí)際樣品檢測

分別稱取牛油果、卷心菜和西蘭花鮮樣3.5 g（2個(gè)重復(fù)），經(jīng)2.1節(jié)方法處理后，在2.2節(jié)儀器條件下上機(jī)測試，由標(biāo)準(zhǔn)曲線定量得到每100 g牛油果、卷心菜和西蘭花鮮樣中NMN的含量分別為6.519 μg、4.091 μg、2.30 μg。

4 結(jié)論

NMN在帕金森、阿爾茨海默癥及糖尿病[15]等疾病治療中有良好表現(xiàn)，在減緩生物體生理衰退、延長壽命等方面有特殊功效，在藥物研制、功能保健食品開發(fā)及化妝品領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。本文建立的蔬菜、水果中NMN的測定方法，具有快速、靈敏、選擇性高等特點(diǎn)；前處理簡單，不需提純、濃縮等步驟，不僅可為蔬菜、水果的營養(yǎng)價(jià)值分析及藥用價(jià)值開發(fā)研究提供技術(shù)支持，還可為人們?nèi)粘Ｉ攀碃I養(yǎng)搭配和病人食療保健提供理論指導(dǎo)。

[1] 趙娟，張健，余志堅(jiān)，等.煙酰胺單核苷酸的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品科技，2018, 43(4): 257–262.

[2] PARK J H, LONG A, OWENS K, et al.Nicotinamide Mononucleotide inhibits post-ischemic NAD (+) degradation and dramatically ameliorates brain damage following global cerebral ischemia[J].Neurobiology of Disease, 2016, 95: 102–110.

[3] YAO Z, YANG W, DAO Z, et al.Nicotinamide Mononucleotide inhibits JNK activation to reverse Alzheimer disease[J].Neuroscience Letters, 2017, 647: 133–140.

[4] LU Lei, TANG Le, WEN Shi, et al.Nicotinamide Mononucleotide improves energy activity and survival rate in an invitro model of Parkinson’s disease[J].Experimental and Therapeutic Medicine, 2014, 8(3): 943–950.

[5] YOSHINO J, MILLS K F, YOON M J, et al.Nicotinamide Mononucleotide, a key NAD(+) Intermediate, Treats the Pathophysiology of Diet-and Age-induced Diabetes in Mice[J].Cell Metabolism 2011, 14(4): 528–536.

[6] GUAN Yi, WANG Surong, HUAN Xinzhong, et al.Nicotinamide Mononucleotide, an NAD(+) Precursor, Rescues Age-Associated Sussceptibility to AKI in a Sirtuin 1-Dependent Manner[J].Journal of the American Society of Nephrology [J].2017, 28(8): 2337–2352.

[7] UDDIN, G M, YOUNGSON N A, DOYLE B M, et al.Nicotinamide Mononucleotide (NMN) supplementation ameliorates the impact of maternal obesity in mice: comparison with exercise[J].Scientific Reports, 2017, 7: Aticle No: 15063.

[8] YAMAMOTO T, BYUN J, ZHAI Peiyong, et al.Nicotinamide Mononucleotide, an intermediate of NAD (+) Synthesis, protects the Heart from Ischemia and Reperfusion[J].Plos One, 2014, 9(6): Article No: e98972.

[9] 魏純純.煙酰胺單核苷酸對(duì)腦出血和腦梗出血轉(zhuǎn)化的作用與機(jī)制[D].上海: 第二軍醫(yī)大學(xué)，2016: 25–33.

[10] DE PICCIOTTO N E, GANO L B, JOHNSON L C, et al.Nicotinamide mononucleotide supplementation reverses Vascular dysfunction and oxidation stress with aging in mice[J].Aging Cell, 2016, 15(3): 522.

[11] LI Jun, BONKOWSKI M S, MONIOT S, et al.A conserved NAD+ binding pocket that vegulates protein-protein interactions during aging[J].Science, 2017, 355(6331): 1312–1317.

[12] DAS A, G HUANG M S, BONKOWSKI M S, et al.Impairment of an Endothelial NAD(+)-H2S signaling Network Is a Reversible Cause of Vasular Aging[J].Cell, 2018, 173(1): 74– 89.

[13] KATHRYN F M, SHOHEI Y, LIANA R S, et al.Long-term administration of nicotinamide mononucleotide mitigates age- associated physiological decline in mice[J].Cell Metab, 2016, 24(6): 795–806.

[14] UMMARINO S, MOZZON M, ZAMPORLINI F, et al.Simultanenous quantitation of nicotinamide riboside, nicotinamide mononucleotide and nicotinamide adenine dinucleotide in milk by a novel enzyme-coupled assay[J].Food Chemistry, 2017, 221: 161–168.

[15] SPINNLER R, GORSKI T, STOLZ K, et al.The adipocytokine nampt and its product NMN have no effect on beta-cell survival but potentiate glucose stimulated insulin secretion[J].Plos One, 2013, 8(1): Article No.: e54106.

Determination of nicotinamide mononucleotides in vegetables and fruits by liquid chromatography-mass spectrometry

LI Dongqin

(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

A rapid determination method of B-nicotinamide mononucleotides by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The shim-pack VP-ODS (150 L×2.0 mm, 5 μm) chromatographic column is used for the chromatographic separation. The mobile phase is methanol and 0.1% acetic acid aqueous solution, the gradient elution is 12 min, and the velocity of flow is 0.3 mL/min. Quantitative determination is used for the multi-reaction ion monitoring mode under positive ion model of mass spectrometry. In the concentration range of 0.1425-228 μg/L, the linearity is good (=0.9998), the recovery rate is from 86.6% to108% and RSD is 3.4%. The determination results show that reproducibility is good with RSD of 2.22%. The quantitative limit of the method is 0.1425 μg/L (/was 10), and the detection limit was 0.07 μg/L (/is 5). The method has high sensitivity and good selectivity, and is suitable for rapid determination of B-nicotinamide mononucleotides in vegetable and fruit nutritional value analysis and medicinal value development research.

nicotinamide mononucleotides, broccoli, cabbage, avocado, liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TS218

B

1002-4956(2019)09-0057-03

2019-02-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31770878）

李東芹（1978—），女，安徽泗縣，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)榇笮蛢x器分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

E-mail:ldq@mail.hzau.edu.cn

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.015