韓 鳳，劉春雷，羅 川，劉 杰，胡開治，肖 忠，林茂祥*

(1．重慶市藥物種植研究所，重慶市 南川區(qū) 408435；2．重慶市中藥良種選育與評(píng)價(jià)工程技術(shù)中心，重慶市 南川區(qū) 408435)

茅蒼術(shù)[Atractylodeslancea(Thunb.)DC.]為菊科多年生草本植物，以干燥根莖入藥，具有悠久的藥用歷史，為傳統(tǒng)大宗藥材之一，具有祛風(fēng)散寒、燥濕健脾、明目等作用[1]。主產(chǎn)于江蘇、浙江、山東、江西、廣東、安徽、湖北、四川等地區(qū)[2-3]。隨著茅蒼術(shù)種植范圍不斷擴(kuò)大，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的互相引種、交流，大田中茅蒼術(shù)表現(xiàn)出栽培類型多樣性。從形態(tài)可以看出，同一居群內(nèi)植株分支的有無(wú)、葉片寬窄、分裂程度以及葉柄有無(wú)，甚至同一植株的葉片有無(wú)分裂，都難以作為區(qū)分變異類型、品系、變種、或者種的標(biāo)準(zhǔn)。由此造成類型的混雜、退化嚴(yán)重，也導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量參差不齊，這些都為茅蒼術(shù)的育種帶來(lái)了很大困難。

目前，RAPD、ISSR、葉綠體DNA等[4-9]分子標(biāo)記應(yīng)用于蒼術(shù)植物研究已有報(bào)道，這些研究為揭示蒼術(shù)屬間親緣關(guān)系及科學(xué)分類提供了非常有價(jià)值的參考，但它們的研究對(duì)象主要是不同產(chǎn)地、不同居群的茅蒼術(shù)，至今尚未有專門針對(duì)引種栽培后茅蒼術(shù)的遺傳多樣性研究的報(bào)道。EST-SSR 作為一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)，而且具有良好通用性。與AFLP、RAPD和ISSR等傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)相比，具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性、多等位性等優(yōu)勢(shì)[10]，使得 EST-SSR 標(biāo)記在實(shí)際應(yīng)用中更具價(jià)值[11]。遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)和重要組成部分，EST-SSR 標(biāo)記為物種遺傳多樣性的分析研究提供一條更有效的途徑。利用EST-SSR標(biāo)記在遺傳圖譜構(gòu)建[12]、親緣關(guān)系和遺傳多樣性[13,14]、引物通用性及輔助選種育種等[15-17]方面的應(yīng)用已取得顯著進(jìn)展。植物在長(zhǎng)期演化、適應(yīng)環(huán)境中，形態(tài)上出現(xiàn)各種各樣的性狀，較多反映在葉片的結(jié)構(gòu)上[18]，葉片形態(tài)學(xué)研究是種質(zhì)資源表型變異研究的重點(diǎn)，已被應(yīng)用在植物種質(zhì)資源研究中[19-21]。鑒于此，為了進(jìn)一步了解茅蒼術(shù)種內(nèi)遺傳變異狀況，了解不同葉形茅蒼術(shù)的遺傳差異，筆者在重慶酉陽(yáng)茅蒼術(shù)主產(chǎn)區(qū)選取大田栽培中不同葉形47份茅蒼術(shù)樣品作為供試材料，采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究其遺傳多樣性，旨在為茅蒼術(shù)種內(nèi)類型的界定提供更多的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為茅蒼術(shù)新品種的培育和種質(zhì)資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試茅蒼術(shù)引種自湖北英山的人工栽培種，將其根莖作為種莖栽培于重慶市酉陽(yáng)茅蒼術(shù)試驗(yàn)基地中。同一生長(zhǎng)期采集植株莖干距離地面15 cm的葉片(裂葉不采集)，葉形根據(jù)葉片長(zhǎng)寬比、葉片質(zhì)地等劃分為5類(見(jiàn)圖1)，分別為長(zhǎng)橢圓形(A)、披針形(B)、卵圓形(C)、橢圓形(D)、倒卵形(E)，樣株間距離不小于20 m，分別采集每一樣株的新鮮幼嫩葉片，用硅膠快速干燥后常溫密封保存、待用。樣品采集信息見(jiàn)表1。

圖1 葉片類型Fig.1 Leaves type

表1 供試茅蒼術(shù)材料Table 1 A. lancea accessions used in this study

1.2 方法

1.2.1 茅蒼術(shù)樣品總DNA的提取與檢測(cè)

每份茅蒼術(shù)樣品取0.1 g嫩葉，用植物基因組DNA試劑盒(Tiangen)提取總DNA，溶于200 μL滅菌超純水中，-20℃保存、備用。再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，用島津紫外分光光度計(jì)(UV-1800)檢測(cè)DNA的純度和濃度，將DNA用TE稀釋至終濃度為50 ng·μl-1，放入-20℃冰箱保存。

1.2.2 引物篩選及SSR- PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)所用引物來(lái)自Shakeel A[22]基于蒼術(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所開發(fā)的SSR引物，隨機(jī)挑選30對(duì)引物，由上海生工公司合成。DL2000 DNA Marker、核酸染料、瓊脂糖(上海生工公司)，2×Taq PCR Master Mi×、d NTP、Taq DNA 聚合酶(北京賽百盛有限公司)，其余試劑均為分析純。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：模板DNA 1.0 μL(約50 ng·μl-1)，1.0 μL引物(10 μmol·L-1)，2.5 μL PCR緩沖液(10×)，Mg2+2 μL(25 mmol·L-1)，d NTPs 2 μL(2.5 mmol·L-1)，Taq DNA 聚合酶1.0U。SSR-PCR 反應(yīng)在梯度 PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))上進(jìn)行。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 45 s ，退火溫度58.5℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；最終延伸72℃ 8 min；4℃保存，采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物拍照保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

假設(shè)電泳圖譜中每一個(gè)條帶均代表了SSR 引物與茅蒼術(shù)模板 DNA 互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，同一引物在相同遷移率位置譜帶模糊或缺失的記為“0”，清晰可辨的記為“1”。統(tǒng)計(jì)所有 EST-SSR 引物擴(kuò)增的結(jié)果，建立“0”、 “1”原始矩陣。用 NT-SY2.10 軟件計(jì)算47份樣品間的遺傳距離(GS)，按非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)對(duì)47份樣品進(jìn)行聚類分析。多態(tài)信息含量PIC值利用Botstein等[23]提供的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR引物擴(kuò)增多態(tài)性分析

從30對(duì)引物中篩選出5對(duì)EST-SSR 引物對(duì)47份供試材料的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出36條重復(fù)性好、擴(kuò)增譜帶清晰的條帶，其中多態(tài)性的條帶36條，占100%(見(jiàn)表2)；其中引物MPC08的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。每條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)目從4至9不等，平均為7.2條，擴(kuò)增條帶片段大小分布在70～270 bp。PIC值用于反應(yīng)引物區(qū)分樣品的能力，與基因型數(shù)目和出現(xiàn)頻率有關(guān)，PIC越高，物種遺傳差異越大，遺傳多樣性越高，同時(shí)也就證明此物種的遺傳背景越復(fù)雜[24]。當(dāng)PIC>0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)性[23]，本研究中，不同引物的PIC值變幅為0.6760～0.7877，平均為0.7539；其中MPC04的PIC值最高達(dá)0.7877，MPC22最低為0.6760，說(shuō)明所篩5對(duì)引物多態(tài)性較高，不同葉形茅蒼術(shù)具有較高的遺傳多態(tài)性。茅蒼術(shù)經(jīng)引種栽培后，葉片形狀變異反映了它對(duì)生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)，這種變異也具有一定的遺傳基礎(chǔ)，是外部形態(tài)上的一種表現(xiàn)形式。所以，茅蒼術(shù)種內(nèi)豐富的遺傳多樣性既與遺傳因素有關(guān)，也與生態(tài)環(huán)境改變的影響密不可分，即是遺傳基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果。

表2 分析所用的EST-SSR引物及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 EST-SSR primers used in this study and the amplified results

2.2 遺傳多樣性與聚類分析

用NTSYS-pc2.10e分析軟件計(jì)算的Jaccard遺傳距離，47個(gè)茅蒼術(shù)遺傳距離系數(shù)在0～0.9123之間，其中，C2與B3的遺傳距離系數(shù)最大為1.01，表明兩者之間的遺傳相似度最??；D10、D5、D9之間和B3、C7、B1之間的遺傳距離系數(shù)均為0。47份供試材料的聚類分析結(jié)果顯示(圖3)，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為 0.630 時(shí)，所有供試樣品被聚為一類；相似系數(shù)為0.666時(shí)，89.36%的供試樣品可聚為一類；在遺傳相似系數(shù)0.700處可以將所有供試材料分為5類。根據(jù)聚類結(jié)果，對(duì)不同葉形進(jìn)行了親緣關(guān)系的系譜追溯，81.25%的D型葉和所有的E型葉均歸為一類，50%C型和70%B型樣品為一個(gè)大類，D7、A1、C2聚為一類，B7單獨(dú)聚為一類，5個(gè)A型葉在4個(gè)分支分支中皆有分布。EST-SSR聚類結(jié)果較好反映供試材料的親緣關(guān)系及不同葉形茅蒼術(shù)的遺傳距離，但并不是相同或者相近特征的茅蒼術(shù)樣品就聚為一類，說(shuō)明茅蒼術(shù)的形態(tài)特征和分子表達(dá)并不一致，也表明茅蒼術(shù)的葉形性狀與遺傳背景不具有明顯的相關(guān)性。這可能是因?yàn)樾螒B(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記屬于不同性質(zhì)的位點(diǎn)，且兩種標(biāo)記方法存在一定的局限性，不可能全面反映種質(zhì)資源的形態(tài)和遺傳特性。因此，實(shí)驗(yàn)中葉形分類與分子標(biāo)記聚類結(jié)果并不完全一致，但卻真實(shí)地反映了茅蒼術(shù)種質(zhì)資源的形態(tài)與遺傳特性。

圖2 引物MPC08的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 DNA fragments amplified by EST-SSR primer MPC08

圖3 基于EST-SSR標(biāo)記的47份茅蒼術(shù)聚類圖Fig.3 Dendrogram of Atractylodeslancea by EST-SSR analysis

3 結(jié)論與討論

植物種間存在變異，種內(nèi)的變異也較大，而種內(nèi)的變異不可忽視[25]。本研究茅蒼術(shù)樣品栽培和田間管理?xiàng)l件一致，但植株的表型性狀在種內(nèi)變異類型之間仍存在較大的差異，主要表現(xiàn)在葉片形態(tài)變化，如葉片大小、是否分裂、厚薄、顏色、葉緣鋸齒，有無(wú)葉柄，植株高矮不一、有無(wú)分枝等外部形態(tài)特征的差異，這為茅蒼術(shù)新品種培育和改良提供了豐富的原始材料。不同葉形茅蒼術(shù)具有豐富多樣性，個(gè)體間(A1和D6)遺傳變異較大，可能是所選擇的代表茅蒼術(shù)植株有限，僅限于酉陽(yáng)黑水鎮(zhèn)茅蒼術(shù)種植基地，給出較為肯定的結(jié)論尚需進(jìn)一步研究。同時(shí)，葉片是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要器官，很多生理生化反應(yīng)在葉片中完成，葉片的形態(tài)指標(biāo)大部分屬于數(shù)量性狀的變異，也受多基因互作的影響[26]。對(duì)于茅蒼術(shù)不同葉形性狀差異受哪些基因決定和調(diào)控的需在今后工作中進(jìn)一步深入研究。

遺傳多樣性最直接的表現(xiàn)形式是遺傳變異水平的高低[27]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同葉形茅蒼術(shù)在DNA水平上表現(xiàn)遺傳距離較大，多態(tài)性百分率為100%、多態(tài)性信息含量平均為0.7539，表明茅蒼術(shù)具有豐富的遺傳多樣性。這一研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致，許夢(mèng)云等[5]用ISSR分析驗(yàn)證得到茅蒼術(shù)較高的多態(tài)性，說(shuō)明茅蒼術(shù)的變異水平亦較高；朱曉琴等[28]通過(guò)對(duì)4個(gè)居群的等位酶分析，發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)居群內(nèi)遺傳變異大于居群間；桑小花等[29]、黃馳等[30]的研究表明茅蒼術(shù)在生理形態(tài)和同工酶表現(xiàn)為多態(tài)性?？赡苡捎诿┥n術(shù)為蟲媒花植物，以異花授粉為主，自交不親和，以及成片連續(xù)分布的特點(diǎn)，使基因較易流動(dòng)；生產(chǎn)中茅蒼術(shù)既可有性繁殖，又能無(wú)性繁殖，從而造成種內(nèi)豐富的變異，為茅蒼術(shù)的多樣性表現(xiàn)提供了理論基礎(chǔ)。由于茅蒼術(shù)在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中，不斷發(fā)生遺傳變化，這種變化是茅蒼術(shù)內(nèi)在遺傳與生態(tài)環(huán)境相互作用的結(jié)果。該研究采用EST-SSR 標(biāo)記進(jìn)行茅蒼術(shù)遺傳多樣性分析，進(jìn)一步豐富了茅蒼術(shù) DNA 遺傳標(biāo)記方法，對(duì)于深入了解茅蒼術(shù)種內(nèi)遺傳關(guān)系以及輔助育種等提供參考和依據(jù)。