王勇，李玉玲，蘇來曼·艾則孜，孫鋒，伍國紅，駱強偉*

（新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200）

葡萄是種植廣泛的重要果樹之一。目前，全世界保存的葡萄資源約5000～15 000個品種[1]。這些品種主要通過雜交、實生選種、芽變、誘變等方法獲得[2]。雜交育種是葡萄育種的重要途徑，這種方式是在人工控制下，通過兩個不同基因型品種的配子結合而獲得新品種[3]。開展葡萄雜交遺傳情況研究，從微觀角度開展遺傳分析，有助于更好地指導葡萄雜交組合選配，把握育種方向，提高育種效率。

SSR標記（Simple Sequence Repeats Maker）是一類由幾個核苷酸（一般為1～6個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列。這些簡單重復序列均勻、隨機，廣泛地分布于真核生物的基因組上，具有數量豐富、多態(tài)性、高信息量、多等位基因、共顯性等特點，被廣泛用于遺傳圖譜的構建[4]、目標基因的標定[5]、指紋圖的繪制[6]等研究中。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2016年3月至2018年12月在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所完成。

1.2 試驗材料

新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所育種材料資源圃7年生歐亞種的‘新郁’葡萄和‘無核白雞心’葡萄及‘新郁（♀）×無核白雞心（♂）’5年生雜交群體62株雜交單株，詳見表1。

1.3 試驗方法

表1 試驗材料Table 1 Test materials

表2 特異性引物序列Table 2 Specific primer sequences

1.3.1 引物序列（表2）

1.3.2 樣品基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法[7]提取葡萄葉片的基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測提取的基因組DNA的片段長度、濃度和純度；通過分光光度計測定并計算DNA溶液的OD260/OD280、OD260/OD230值，若前者值在1.60～1.90，后者值＞2.0可用于PCR擴增。

1.3.3 PCR反應體系及反應程序

使用PCR反應體系為：PCR MiX混合液（ng/μL）10 μL，SSR雙引物混合液（ng/μL）0.8 μL，模板（20 ng/μL）2.0 μL，ddH2O 7.2 μL，總反應體系為20 μL，PTC-100型PCR儀上進行反應。

擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，45～65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后一個循環(huán)72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。在操作中根據各引物差異進行體系優(yōu)化。

1.3.4 PCR產物的電泳分離

（3）上海“快樂30分”。上海目前93%的公辦小學已提供晚托服務，開設了“快樂30分”綜合活動和看護服務兩項內容。長寧區(qū)已實現晚托服務公民辦小學全覆蓋；嘉定區(qū)則把為學生積淀人文素養(yǎng)、強健體魄和培育特長相融合，99.29%的家長對此表示滿意，30%的孩子已經由原先學費高昂的培訓學校“回流”到學校。

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。制膠加入ddH2O 40 mL，10×TBE 4 mL，40%Acr-Bis 8 mL，TENMED 40 μL，10%APS 400 μL，在電磁攪拌器上攪拌均勻后，搖勻后迅速倒入凝膠槽中，若有氣泡，將氣泡趕到邊上，迅速裝好梳子。待凝膠完全凝固后，將凝膠槽安放于電泳槽中，加入足夠量的0.5×TBE于電泳槽中，輕輕拔下梳子，使電泳槽中緩沖液覆蓋凝膠。

準備DNA樣品液：在點樣板各小坑中，加PCR產物約5 μL，均勻點樣。每排第一個點樣孔點一個PCR Marker作為分子量標記，接好電泳儀的正負極，樣品池應連接負極，打開電源進行電泳。約3 h，指示劑遷移到一定距離時，結束電泳。置凝膠于LED發(fā)光箱下，觀察分離的DNA條帶，照相。

1.3.5 PCR產物的電泳分離

在電腦上對凝膠電泳圖片進行分析，每張圖片上，第一個泳道是分子量標記PCR Marker，第二個是母本，第三個是父本。通過Marker找到目的條帶所處的大致位置，進而找到父本泳道的特異條帶，然后與后面的各株對應的泳道進行比較，觀察那些泳道出現與目的帶在一條線上的條帶，記下這些單株。

表3 ‘新郁’與‘無核白雞心’之間6對多態(tài)性特異引物的多態(tài)性與父本特異性Table 3 Polymorphism and paternity specificity of six pairs of polymorphic specific primers between 'Xinyu' and 'Centennial Seedless'

表4 引物Vchr4a對‘新郁’與‘無核白雞心’雜交群體遺傳多態(tài)性與特異性檢測情況Table 4 Detection of genetic polymorphism and specificity of 'Xinyu' and 'Centennial Seedless' hybrids by primer Vchr4a

2 試驗結果與分析

2.1 2對SSR標記引物對‘新郁’與‘無核白雞心’葡萄的擴增結果

利用葡萄SSR標記引物Vchr4a和Vchr15a分別對‘新郁’與‘無核白雞心’進行了PCR擴增和電泳檢測，分析結果見表3。引物Vchr4a在‘新郁’與‘無核白雞心’之間擴增出了6條多態(tài)性條帶，其中4條是在‘新郁’上擴增的，2條是在‘無核白雞心’上擴增的，且條帶長度在100～200 bp，根據條帶大小順序編號為m1、m2、m3、m4、m5、m6。m2和m4是‘無核白雞心’所具有，視為特異條帶。引物Vchr15a在‘新郁’與‘無核白雞心’之間擴增出了5條多態(tài)性條帶，其中3條是在‘新郁’上擴增的，2條是在‘無核白雞心’上擴增的，且條帶長度在100～200 bp，根據條帶大小順序編號為n1、n2、n3、n4、n5。n1和n3是‘無核白雞心’所具有，視為特異條帶。

2.2 SSR特異引物Vchr4a對‘新郁×無核白雞心’雜交群體的擴增

利用葡萄SSR標記引物Vchr4a對62株‘新郁×無核白雞心’雜交組合進行PCR擴增和電泳檢測，結果見表4和圖1。引物Vchr4a在親本‘新郁’與‘無核白雞心’之間擴增的6條多態(tài)性條帶，在‘新郁×無核白雞心’F1代的遺傳上表現為7種類型。m1+m3+m4+m5+m6型最多為29個，占46.78%；其次為m3+m5型為18個，占29.03%。母本‘新郁’所具有的4條條帶分布于整個群體。父本‘無核白雞心’具有的2個條帶與母本‘新郁’所具有的4個條帶組合表現為5種類，共分布于41個單株中。這說明引物Vchr4a所標記的基因，就‘新郁’而言，遺傳給后代的能力強。該標記至少能確定群體中41個單株是‘無核白雞心’的雜種。

圖1 引物Vchr4a對‘新郁×無核白雞心’雜交組合的擴增結果Figure 1 Amplification results of primer Vchr4a in 'Xinyu×Centennial Seedless' hybrid combinations

2.3 SSR特異引物Vchr15a對‘新郁×無核白雞心’雜交群體的擴增

利用葡萄SSR標記引物Vchr15a對62株‘新郁×無核白雞心’雜交組合進行PCR擴增和電泳檢測，結果見表5和圖2。引物Vchr15a在親本‘新郁’與‘無核白雞心’之間擴增的5條多態(tài)性條帶，在‘新郁×無核白雞心’F1代的遺傳上表現為4種類型。n2+n4型最多為48個，占77.42%，其次為n3+n5型為12個，占19.35%。母本‘新郁’所具有的3個條帶分布于整個群體。父本‘無核白雞心’具有的2個條帶與母本‘新郁’具有4個條帶組合表現為3種類，共分布于14個單株中。這說明引物Vchr15a所標記的基因，就‘新郁’而言，遺傳給后代的能力也很強。該標記至少能確定群體中14個單株是‘無核白雞心’的雜種。

圖2 引物Vchr15a對‘新郁×無核白雞心’雜交組合的擴增結果Figure 2 Amplification results of primer Vchr15a in 'Xinyu×Centennial Seedless' hybrid combinations

3 討論與結論

分子標記技術是一種以DNA多態(tài)性為基礎，通過檢測DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長短與排列不一的重復序列等機制而產生多態(tài)性的技術。該技術不受環(huán)境因素及發(fā)育階段的影響，具有快速、簡單、準確、可靠、穩(wěn)定、經濟等特點，特別是SSR標記技術因具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，在葡萄的分子標記輔助育種中應用的比較廣泛。Thomas等[8]、Bowers等[9-10]、Sefc等[11]相繼開發(fā)了9個適合葡萄品種鑒定的SSR引物：VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD32、VVMD28、VVMD27、VVMD25、VrZAG79、VrZAG62。在國際上，法國、德國、意大利等利用該9對引物建立了葡萄品種分子數據庫（www.vivc.de），在線為葡萄科研工作者提供查詢服務，為國際上葡萄品種的鑒定與交換奠定了基礎。但遺憾的是，該數據庫中不包含中國育成品種。目前，在葡萄基因組上已經定位了753個SSR標記[12]，這為葡萄雜交真?zhèn)涡澡b別提供了理論依據。李貝貝等[13]利用SSR分子標記技術對314份葡萄品種進行了DNA指紋數據庫構建和遺傳多樣性分析。樊秀彩等[14]以山葡萄、河岸葡萄以及239株二者的雜交后代為材料，利用SSR引物作為雜種鑒定的標記，進行了有效地葡萄屬種間雜種真?zhèn)涡澡b定。憲立杰等[15]利用SSR標記技術對45個葡萄品種進行了遺傳多樣性分析，并建立了葡萄品種SSR基因型指紋庫。杜晶晶[16]應用9對SSR引物構建了80份葡萄種質的有效分子身份證。郭春苗等[17]利用4條SSR標記引物構建了新疆44個適宜制干葡萄品種DNA指紋圖譜。在此基礎上，本文從中選擇2對標記開展‘新郁’與‘無核白雞心’基因測定，研究定位基因遺傳情況，進一步完善分子標記輔助育種技術，為自育葡萄雜交真?zhèn)涡澡b定和指紋圖譜構建奠定基礎。

本文認為，兩個SSR引物所標記的母本‘新郁’的遺傳物質能夠在雜交群體中普遍遺傳，父本‘無核白雞心’的遺傳物質在雜交群體中表現為部分遺傳。SSR標記引物Vchr4a與Vchr15a可以用來鑒定該組合的雜交真?zhèn)涡?，Vchr4a所標記的基因比Vchr15a標記的遺傳能力強。但葡萄是具有高度雜合基因的多年生植物，單靠1條或2對引物不能完成群體的雜交真?zhèn)涡澡b定。