裴丹，葛孟清，董天宇，魏新科，劉崇懷，房經(jīng)貴*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹所/農(nóng)業(yè)部果樹育種重點實驗室，河南鄭州 450009）

葡萄（2X=38）是二倍體植物。其在進化與利用過程中，形成了很多不同倍性的葡萄品種，且葡萄無性繁殖的特點能將多倍體的優(yōu)良性狀穩(wěn)定地保存下去。由于多倍體葡萄具有生長旺盛、枝粗、葉厚、果大、產(chǎn)量高、同化物質(zhì)含量高、種子數(shù)量少且部分發(fā)育不良，果實成熟期提前等優(yōu)點，在生產(chǎn)上廣泛推廣。

染色體鑒定方法分為直接鑒定法與間接鑒定法。直接鑒定法又稱染色體計數(shù)法，可直接鑒定染色體倍性。這種方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，但耗時長，對操作要求高，不適宜大量樣品材料的倍性鑒定。間接鑒定法不能直接進行染色體計數(shù)，是通過觀察植株形態(tài)、細胞形態(tài)，進行雜交試驗或微觀分子技術(shù)來間接進行染色體倍性鑒定。其中，植物形態(tài)學(xué)鑒定法較為簡便，但受個人主觀因素影響較大；細胞形態(tài)學(xué)鑒定法比較可靠，但操作過程復(fù)雜；梢端組織鑒定法能夠準(zhǔn)確鑒定嵌合體倍性；雜交鑒定倍性所需時間較長，且需事先了解植物遺傳規(guī)律[1]。流式細胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是應(yīng)用流式細胞儀進行分析、分選的技術(shù)，對處于液流中的各種熒光標(biāo)記微粒進行多參數(shù)快速準(zhǔn)確地定性、定量測定。在植物學(xué)研究中，F(xiàn)CM主要用于檢測植物細胞核DNA含量[2]及其倍性水平[3]，其中分裂間期G1期的DNA含量可間接反映該細胞的倍性水平，因此測定植物細胞核DNA含量的同時可以獲取倍性水平相關(guān)數(shù)據(jù)，繪制成流式圖譜，峰圖縱坐標(biāo)為粒子數(shù)，橫坐標(biāo)為相對熒光強度。

葡萄染色體倍性的信息對于葡萄品種資源的科學(xué)利用具有參考價值[4]。本文對目前中國自主育成的部分葡萄品種進行倍性鑒定，以期為葡萄倍性鑒定及多倍體育種提供理論依據(jù)。同時，鑒別葡萄倍性水平還對研究其系統(tǒng)進化、澄清物種起源模式具有非常重要的意義[5]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

隨機取自中國農(nóng)科院鄭州果樹所國家葡萄資源圃以及其他院所保存的208個葡萄品種。選取植株幼嫩葉片，經(jīng)冰袋運輸后置于4 ℃下保存，在最短時間內(nèi)完成測定。

1.2 實驗方法

1.2.1 緩沖液的配制

解離細胞核所用的解離液按照表1[6]中的配方配制，通過試驗進行篩選。

染色緩沖液為解離液中加入20 mg/L碘化丙啶（PI）和20 mg/L的RNA酶。

表1 解離液種類及組分Table 1 Categories and componets of dissociation solutions

1.2.2 細胞核溶液的制備

（1）稱取約1 g幼嫩的葡萄葉片，蒸餾水洗凈表面塵土，濾紙吸干后放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入預(yù)冷的解離液（1 mL），用鋒利的刀片一次性快速切碎，整個過程材料需浸沒在解離液中，以便更好地游離細胞核。

（2）吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的解離液，用300目的濾膜過濾至1.5 mL離心管中，然后置于4 ℃冰箱中，孵育5 min。

（3）1000 r/min，離心5 min，溫度為4 ℃。

（4）棄上清后，再加入200 μL預(yù)冷的染色緩沖液，4 ℃避光染色5 min。

1.2.3 流式細胞術(shù)測定

樣品的細胞核DNA含量在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗教學(xué)中心大型儀器共享平臺進行檢測。所用機型為美國BD（Becton, Dickinson and Company）公司生產(chǎn)的Accuri C6 Ⅱ流式細胞儀。光源由波長為488 nm氬離子激發(fā)，染色的DNA分子促發(fā)熒光，測定其熒光強度，與測定裝置相連的計算機分析軟件即可對熒光強度進行分析。本次實驗所有測試樣品的細胞核DNA含量是以對照為標(biāo)準(zhǔn)的相對值，每次檢測至少收集10 000個顆粒。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄染色體流式細胞檢測技術(shù)體系的建立

2.1.1 解離液的篩選

流式細胞儀的結(jié)果圖中通常會出現(xiàn)樣本峰和碎片峰，理想的樣本峰應(yīng)為左右對稱且峰型集中，而單坡峰則是碎片峰。在控制處理一致的條件下，使用上述3種解離液對葡萄葉片解離后進行流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)otto's（圖1A）和LB01（圖1B）處理的葡萄葉片都無法產(chǎn)生完整的樣本峰，葉片細胞核DNA含量少，碎片峰面積大。WPB（圖1C）對于葡萄葉片的解離效果最好，其樣本峰峰型集中，碎片峰面積小，測定結(jié)果準(zhǔn)確。故選用WPB作為解離液。

2.1.2 FCM檢測葡萄倍性方法的建立

使用WPB解離液解離葡萄葉片后，經(jīng)流式細胞儀分析樣品的細胞核情況，僅檢測到了一個峰（G1期），G1期細胞核DNA的含量可以反應(yīng)細胞的倍性水平，且隨著倍性水平的增高，細胞核DNA含量增加，如二倍體‘玫瑰香’的峰值出現(xiàn)在橫坐標(biāo)50處，三倍體‘夏黑’的峰值出現(xiàn)在橫坐標(biāo)75處，四倍體‘巨峰’的峰值出現(xiàn)在橫坐標(biāo)100處（圖2）。因此，可根據(jù)熒光強度的相對位置判斷葡萄品種的倍性情況。

在同一次試驗中出現(xiàn)如圖3所示，A峰為‘京紫晶’（2N），B峰為 ‘鄭果28號’（2N），二者DNA含量的相對熒光強度有細微的差異。這可能是由于非整倍體造成的，類似的研究也曾在香蕉上有過報道[7]。

圖1 三種解離液篩選結(jié)果Figure 1 Screening results of three dissociation solutions

圖2 三種倍性的葡萄DNA含量分布Figure 2 Nuclei DNA content of 3 different types grape ploidy

圖3 兩個二倍體葡萄品種的DNA含量Figure 3 DNA content of two diploid grape varieties

2.2 葡萄染色體的倍性分析情況

對208份葡萄品種材料檢測后，獲得了其倍性情況（表2，見文后）。

其中共有二倍體品種138個，三倍體品種11個，四倍體品種59個。其中自育品種二倍體106個，三倍體9個，四倍體47個；國外引進的品種二倍體32個，三倍體2個，四倍體12個（表3）。

2.3 葡萄染色體的倍性與果粒大小

四倍體中特大粒果的比例明顯高于二倍體和三倍體葡萄果實（表4），在同一親本不同倍性條件下，果粒大小也有顯著差別，如‘四倍體玫瑰香’的平均粒質(zhì)量為7 g，‘玫瑰香’（2N）的平均粒質(zhì)量為5 g；‘紅太陽’（芽變紅地球，4N）的平均粒質(zhì)量為18 g，‘紅地球’（2N）的平均粒質(zhì)量為12 g[8]。證明在多倍體化的過程中，葡萄的果粒也顯著增大。

3 討論與結(jié)論

對于染色體數(shù)目較多的材料，直接鑒定法難度高，且耗時長。而利用流式細胞儀能夠迅速準(zhǔn)確地判斷葡萄倍性水平[9]。細胞核內(nèi)DNA分子數(shù)目越多，DNA分子鏈越長，PI嵌入的量就越多，經(jīng)激光照射，促發(fā)熒光強度越強。因此，在同一條件下，可利用DNA所發(fā)熒光強度的強弱判斷細胞核DNA含量的多少。在判斷大量樣品的倍性時，可根據(jù)已知倍性葡萄品種的峰值位置來判斷位置樣品的倍性[10]。但是利用流式細胞儀測定基因組DNA含量還存在一些問題，如樣品制備、染色、標(biāo)樣等均會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響，所以不易鑒別出非整倍體，如有需要可以通過細胞學(xué)進行準(zhǔn)確鑒定。

表3 國內(nèi)外葡萄品種倍性情況Table 3 Ploidy of domestic and abroad grape varieties

表4 不同倍性間果粒大小情況Table 4 Berry size among different ploidy

在本試驗統(tǒng)計的208個葡萄品種中，二倍體葡萄品種最多占66.3%；現(xiàn)代栽培的葡萄四倍體品種大多是從自然產(chǎn)生的突變體（芽變）衍化和秋水仙素誘導(dǎo)而來，故四倍體品種占比較低，為28.4%；由于利用二倍體和四倍體進行有性雜交的親和力差，雜種胚早期敗育或胚乳解體，很難獲得雜交后代。即便利用胚挽救技術(shù)也很難保證成活率，所以三倍體品種最少，僅有5.3%[11]。通過分析品種倍性與果粒大小認為，在多倍體化的過程中，葡萄的果粒也顯著增大。因此，多倍體育種是獲得大粒葡萄新品種的重要途徑之一。

表2 208個葡萄品種倍性Table 2 Ploidy of 208 grape cultivars

續(xù)表2 Continued table 2

續(xù)表2 Continued table 2

續(xù)表2 Continued table 2