傅偉紅，魏新科，葛孟清，劉崇懷*，房經(jīng)貴*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹所，河南鄭州 450009）

葡萄栽培歷史悠久，品種繁多。目前，已發(fā)現(xiàn)的葡萄屬種質(zhì)資源有70多個種，已登記的品種有1.6萬個，而中國種質(zhì)資源圃中保存的大約有2000多種[1-2]。葡萄在自然條件下極易產(chǎn)生芽變，同時在長期人為活動如引種、選種、交換、栽培中也易發(fā)生混亂，同名異物或同物異名現(xiàn)象非常嚴重。而且隨著栽培范圍的擴展，育成種質(zhì)數(shù)目呈快速增長趨勢，使得葡萄的選育和推廣面臨許多困難[3]。

本文所選的72個品種包括國內(nèi)自育品種以及許多國外引進的優(yōu)良品種，大部分是品質(zhì)優(yōu)良的釀酒品種，還有一些是釀酒鮮食兼用品種，在我國葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中具有重要地位。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定由于易受環(huán)境條件的影響，已逐漸不能滿足需求[4]，因此繪制直觀可靠的品種鑒定圖，對于苗木早期鑒定、品種權(quán)利保護、生產(chǎn)中品種的區(qū)分和命名以及葡萄種質(zhì)資源的評價等具有重要的實際意義[5-6]。

DNA分子標記是以個體間核苷酸差異為基礎(chǔ)，建立在分子水平上的遺傳標記技術(shù)，在植物育種和遺傳資源管理中有著廣泛的應(yīng)用[7-8]。DNA分子標記具有高度專一性和特異性、信息量大，還有操作方便、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點，且與形態(tài)、生理和生化指標等方法比較，其在鑒定作物新品種及檢測種子純度方面具有很大優(yōu)勢[9-12]。但是，由于缺乏可以將DNA指紋轉(zhuǎn)化為品種區(qū)分信息的理想措施，無法使其在品種鑒定中的優(yōu)勢發(fā)揮出來，以往利用二元表與進化樹等呈現(xiàn)不同植物材料或品種的鑒定結(jié)果，僅僅表達DNA標記能夠區(qū)分這些品種的技術(shù)優(yōu)勢，但難以提供用于區(qū)分這些品種可依據(jù)的實用性的鑒定結(jié)果。

MCID法（Manual cultivar identification diagram）是一種新的基于DNA分子標記的人工繪制品種鑒別示意圖的方法。該方法對同一引物PCR擴增后的多態(tài)性譜帶進行分類，把電泳后具有相同譜帶的分為同一組，有特異性譜帶的則被區(qū)分出來，在圖上標記相應(yīng)的引物和譜帶，從而繪制準確、直觀、實用的品種鑒定圖[13]。MCID方法的應(yīng)用不僅可以使RAPD、SSR等DNA標記在鑒定果樹品種中的利用成為實用性的簡便工具，更使DNA標記技術(shù)在果樹乃至生物樣品鑒定中的優(yōu)勢得到了充分實現(xiàn)[14]。該方法真正意義上將DNA指紋技術(shù)鑒定品種獲得的結(jié)果轉(zhuǎn)化為簡便、利用價值很高的能具體指導(dǎo)品種鑒定實踐的實用信息，最終獲得的品種鑒定圖（CID）能夠成為植物品種快速鑒定的依據(jù)。該方法已經(jīng)在多種植物品種的分類、種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)研究、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面較為廣泛地應(yīng)用。孫鈞等[13]利用5對SSR多態(tài)性引物成功鑒定了14份白沙枇杷資源，并構(gòu)建了相應(yīng)品種鑒定圖譜。黃丹娟等[15]基于SSR熒光標記的MCID法鑒定了13種茶樹品種。許園園等[16]基于RAPD擴增，利用MCID方法對20個蘿卜品種進行鑒定，同時進行遺傳多樣性分析。

本研究利用國際通用的6對SSR引物，結(jié)合MCID法對待鑒別的72個釀酒葡萄品種的DNA進行PCR擴增，對SSR結(jié)果進行分子鑒定和初步的遺傳多樣性分析，繪制品種鑒定圖，以期將72個品種在分子水平準確地區(qū)分，同時為釀酒葡萄品種鑒定與資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的72種釀酒葡萄品種的試驗材料均來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所。選取的材料為國內(nèi)釀酒葡萄品種以及常見國外釀酒品種的新梢幼葉，裝入冰盒之中帶回實驗室，之后先用蒸餾水洗干凈葉片，去除葉脈并用吸水紙吸干，用液氮速凍然后置于-40 ℃冰箱暫時保存。葡萄品種詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取葉片50 mg研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。采用傳統(tǒng)CTAB法提取樣品的基因組DNA，使用核酸蛋白測定儀（Nano-100）測定DNA樣品濃度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質(zhì)量。并用ddH2O稀釋至50 ng/μL于-20 ℃保存?zhèn)溆茫跏紳舛鹊腄NA同樣在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 引物篩選與構(gòu)建

試驗參照國際葡萄品種目錄數(shù)據(jù)庫（Vitis Internationl Variety Catalogue, VIVC, http://www.vivc.de/）公布的9對葡萄國際通用引物進行篩選分析，引物序列由通用生物公司合成。選擇3個遺傳差異較大的葡萄DNA對9對引物進行篩選，經(jīng)過PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳，從中選取擴增條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物用于所有DNA 樣品的擴增。引物序列及退火溫度見表2。

表1 供試葡萄品種介紹Table 1 Grape cultivars used in this study

表2 SSR引物及退火溫度Table 2 The SSR primers and annealing temperature used in this study

1.2.3 PCR擴增與檢測

PCR反應(yīng)液體系為25 μL，其中含DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，2×Hieff PCR Master Mix（YEASEN公司生產(chǎn)）12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，保存4 ℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測

SSR-PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）中電泳分離，用雙蒸水清洗電泳后的凝膠，清洗完畢用0.2% AgNO3溶液震蕩染色2 min，之后置于顯色液中進行顯色反應(yīng)，顯色液配方為1.5%NaOH:37%甲醛=300:1。直至條帶清晰，在燈光下對條帶進行觀察并做好記錄、統(tǒng)計，用相機拍照后保存圖像用于后續(xù)分析制作CID。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將SSR分子標記統(tǒng)計基因型轉(zhuǎn)化為0-1數(shù)據(jù)，先在電泳圖上選取一個長度，將在同一分子量上，有特征條帶的記為1，沒有條帶的記為0，數(shù)據(jù)缺失記為9，以此得到數(shù)據(jù)庫。利用NTSYS-pc 2.10e軟件中Similarity選項下的Qualitative data模塊得到遺傳相似系數(shù)矩陣，由遺傳相似系數(shù)矩陣在Clustering選項中的SHAN模塊，進行UPGMA聚類分析，通過Tree plot程序得到聚類圖。

1.2.6 人工繪制植物品種鑒別圖法

在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中選取能擴增出清晰條帶的引物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以此鑒定72個釀酒葡萄品種。首先選擇其中某一對引物的PCR擴增電泳圖譜，對在相同電泳遷移率處（相同分子量片段）的特異性條帶進行多態(tài)性統(tǒng)計，有擴增譜帶的品種歸類為一組，沒有譜帶的歸類為另一組。通過這種方法，擴增后能產(chǎn)生唯一特異性條帶的品種就可以首先被區(qū)分鑒別出來，其余具有相同大小帶型的品種則被分成幾個不同的亞組。再通過其他更多引物逐級區(qū)別每個亞組中的品種，直至所有待鑒別的品種都被單獨區(qū)分。最后，通過對比譜帶后獲得的分組信息，人工繪制直觀的品種鑒別圖譜，在樹形鑒別圖上將每一次篩選用的引物以及多態(tài)性譜帶大小逐一進行標記[9,16-17]。人工繪制的植物品種鑒別圖是在PCR擴增后，對獲得的譜帶形態(tài)進行分析，以引物作為節(jié)點，以特征譜帶的有無作為分類的依據(jù)，充分、直觀地反映出6對通用引物鑒別區(qū)分72個釀酒葡萄品種的圖譜關(guān)系。

圖1 引物組合VvMD27擴增72個釀酒葡萄品種Figure 1 Primer VvMD27 amplification of 72 wine grape varieties

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR引物篩選結(jié)果

初步選擇9對擴增條帶清晰且多態(tài)性好的引物（VvS2、VvMD5、VvMD7、VvMD25、VvMD27、VvMD28、VvMD32、VvMD62、VvMD79），通過統(tǒng)計，從中篩選出6對引物進行CID的制作（VvMD27、VvMD28、VvMD32、VvS2、VvS7、VvS5）。圖1是引物組合VvMD27對72個品種的擴增電泳圖，分析可見，這些引物均能在供試樣品中擴增出清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性和多態(tài)性較高的條帶。說明對應(yīng)編號的引物都可為SSR引物篩選提供參考。

2.2 遺傳多樣性分析

以從9對引物組合中篩選的擴增條帶清晰且有明顯多態(tài)性片段的8對引物的SSR擴增產(chǎn)物為基礎(chǔ)，通過NTSYS-pc 2.10e 軟件得到72個釀酒葡萄品種的聚類圖（圖2）。

由圖2分析可知，分子標記可以有效的將72個釀酒葡萄品種區(qū)分開。在遺傳相似系數(shù)為0.52左右時，可以分為4個類群，其中，類群Ⅰ包含20個品種，類群Ⅱ包含13個品種，類群Ⅲ包含14個品種，類群Ⅳ包含25個品種，表明大多數(shù)材料之間存在著顯著的遺傳差異。以類群Ⅱ中的15份材料為例，‘小黑葡萄’（4）、‘西爾瓦’（11）、‘黑格蘭’（32）、‘艾布林’（14）、‘白比諾’（15）、‘佳利釀’（36）、‘黑佳釀’（7）、‘阿利戈特’（12）、‘貴人香’（30）、‘黑佳美’（33）、‘紅玫瑰’（34）共11個歐亞種被聚類在這個類群，但是歐美雜種‘巴柯’（5）和歐山雜種‘北玫’（21）也被聚在了類群Ⅱ中。其中有5個品種來源于法國，3個品種來源于中國，2個品種來源于德國，2個品種來源于西班牙，1個品種來源于保加利亞。以上結(jié)果說明這13份材料的遺傳多樣性與其所屬種有一定關(guān)系，而與地理來源關(guān)系不大。

由于聚類分析產(chǎn)生的樹狀圖和系統(tǒng)發(fā)育樹無法顯示特定的引物和多態(tài)性標記等可參考的信息，限制了分子標記在品種鑒定中的實際應(yīng)用。葡萄品種鑒定是一個重要研究領(lǐng)域，隨著葡萄品種的不斷增多，想要對這些釀酒葡萄進行正確的鑒定與分類的需求也越來越迫切。因此，建立一個快速、簡便、切實可用的分析措施將會使DNA分子標記在品種鑒定中發(fā)揮重要作用[18]。

2.3 釀酒葡萄品種鑒定

利用SSR建立72個釀酒葡萄的MCID，結(jié)合篩選的6對引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，運用MCID法將72個品種逐一單獨區(qū)分鑒別出來。為了觀圖簡潔方便，將每個品種的編號用對應(yīng)的數(shù)字表示。

首先根據(jù)引物VvMD27擴增的電泳圖上大小為250 bp、310 bp和370 bp的3條特征性條帶的有無將72個品種分成7組，將有特征性譜帶的用(+)表示，沒有特征性譜帶的用(-)表示。第1組是250 bp(+)、310 bp(-)和370 bp(-)，包括9個品種；第2組為250 bp(+)、310 bp(+)和370 bp(-)，包括15個品種；第3組是250 bp(+)、310 bp(-)和370 bp(+)，包括5個品種；第4組只有310 bp譜帶，缺失250 bp和370 bp譜帶，包括7個品種；第5組是250 bp(-)、310 bp(+)和370 bp(+)，包括8個品種；第6組只有370 bp譜帶的分組，包括10個品種；第7組為3條特征性譜帶250 bp、310 bp和370 bp均不含有的共18個品種。

利用引物VvMD27將72個品種分為7類之后，繼續(xù)利用更多的引物分別鑒定7個組的所有品種。以第2組的15個品種為例，先利用引物VvMD28進行擴增，首先鑒定出同時具有250 bp、330 bp兩條多態(tài)性譜帶的‘小黑葡萄’（4）。其余14個品種被分成3組，有250 bp譜帶，沒有330 bp譜帶的為2-1組，包括6個品種；有330 bp譜帶，沒有250 bp譜帶的為2-2組，包括3個品種；兩條譜帶均沒有的為2-3組，包括5個品種。再利用引物VvMD32進行擴增，只有240 bp條帶，缺失350 bp條帶的‘甲州’（37）被鑒定出來；同時具有240 bp和350 bp條帶的是‘北醇’（19）、‘卡拉’（38）、‘長相思’（44）；只有350 bp條帶，缺失240 bp條帶的為‘郁金香’（53）和‘小白’（61）。之后繼續(xù)利用引物VvS2擴增，有200 bp條帶，缺失260 bp條帶的‘長相思’（44）被單獨鑒定出來；有260 bp條帶，缺失200 bp條帶的為‘北醇’（19）和‘卡拉’（38）兩個品種。最后通過引物VvS7進行擴增，具有250 bp條帶的為‘卡拉’（38），缺失250 bp條帶的為‘北醇’（19）。2-2組和2-3組的品種同樣可以利用VvMD32和VvS2分別鑒定。

其他6組按照此方法依次鑒定，利用6對引物就可以區(qū)分所有品種。最后，根據(jù)所有引物及相應(yīng)譜帶信息繪制72個品種的鑒定圖，即釀酒葡萄品種CID（圖3）。

MCID是一種可以簡單快速地鑒別任何品種的方法，具體步驟是先根據(jù)擴增條帶的有無以及多態(tài)性篩選待鑒定品種區(qū)分所需引物，利用篩選出的引物進行PCR擴增，最后對PCR擴增的多態(tài)性條帶進行分析觀察，分步將待鑒定品種區(qū)分出來。例如：區(qū)分‘香寶馨’（2）和‘晚紅蜜’（45）2個釀酒葡萄品種，在MCID中分別找到品種對應(yīng)數(shù)字2和45。我們發(fā)現(xiàn)，用引物組合VvS7即可區(qū)分2個品種，利用該引物對，‘香寶馨’在250 bp處有特異性條帶，而‘晚紅蜜’則沒有，簡單快速達到區(qū)分品種的目的。同樣，如果區(qū)分‘西爾瓦’（11），‘阿利戈特’（12）和‘灰比諾Fr70/125A’（35）3個品種時，首先在MCID上得到3個品種最先分支的引物為VvS2，多態(tài)性條帶為260 bp和200 bp，通過該引物可將3個品種分為‘阿利戈特’（12）、‘西爾瓦’（11）與‘灰比諾Fr70/125A’（35）兩組，之后再利用VvS7引物和250 bp條帶將‘西爾瓦’與‘灰比諾Fr70/125A’區(qū)分，這樣3個品種就能完全區(qū)分。

圖2 72個釀酒葡萄品種基于SSR分析的聚類圖Figure 2 UPGMA dendrogram of the 72 wine grape varieties on the basis of SSR markers

3 討論與結(jié)論

葡萄是世界上重要的果樹之一。在葡萄生產(chǎn)中，對獲取的優(yōu)良新品種進行保護時，該品種應(yīng)被鑒定，與已有品種準確區(qū)分[19]。隨著葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)的擴大，對釀酒葡萄資源的收集評價、特異種質(zhì)的挖掘變得尤為重要，這就需要找到一種兼具準確性和實用性的植物品種鑒定方法。DNA分子標記技術(shù)與形態(tài)標記、細胞學(xué)標記和生化標記相比，優(yōu)越性明顯，具體表現(xiàn)在多態(tài)性高、數(shù)量極多、不影響目標性狀的表達等方面[20]。一些DNA標記技術(shù)例如SSR、ISSR、RAPD、AFLP等因其各自的優(yōu)勢特點，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各類植物遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定工作中。

圖3 6對引物鑒別區(qū)分72個釀酒葡萄品種的MCID示意圖Figure 3 MCID of 72 wine grape varieties by using six pairs of SSR primers

以上的DNA分子標記技術(shù)多在構(gòu)建指紋圖譜后利用聚類分析進行品種之間遺傳差異的探究，無法作為品種鑒定的根本依據(jù)。而MCID法很好地解決了品種鑒定的問題，一般只需要幾對引物就能鑒定較多品種，且操作簡單、直觀有效、穩(wěn)定性高、實用性強[21]。目前MCID 法已經(jīng)被用于多個樹種的鑒定，如利用基于SSR標記的MCID法鑒定白沙枇杷、茶樹、柿等[13,15-16]，基于RAPD標記的MCID法鑒定葡萄、青花菜等[17,22]，這些研究都表明了MCID法在鑒定品種上的可行性。

本研究利用NTSYS-2.10e軟件的聚類分析功能，通過8對引物擴增的多態(tài)性條帶，將72個釀酒葡萄品種在遺傳相似系數(shù)為0.52左右時分為4個類群，簡單區(qū)分了個別遺傳關(guān)系較遠的品種，但這種方法不能將遺傳關(guān)系相近的品種單獨鑒定。本研究同時進行的基于SSR標記的MCID方法解決了這個問題，只用了6對引物構(gòu)建了72個釀酒葡萄品種的MCID圖譜，快速、準確地進行鑒別。圖譜直觀顯示了整個鑒別過程，在葡萄品種一定的情況下，可以簡單明了找出各品種鑒定所需要的引物及其對應(yīng)的特異性條帶長度。隨著葡萄新品種的培育以及種質(zhì)資源調(diào)查的深入，需要鑒別的品種不斷增加，可以利用本研究所使用的6對引物進行多次PCR擴增，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型將其標注在MCID圖譜的相應(yīng)位置上，即可獲得包含更多新品種的MCID圖。若現(xiàn)用引物無法鑒別新品種，則選用新引物再進行區(qū)分。

基于SSR標記的MCID法較其他分子標記鑒定方法有了較大突破，即利用盡可能少的引物擴增，根據(jù)不同引物所獲得的特異性譜帶依次鑒定出所有品種，操作簡便、目的性強，更適用于大量品種的快速鑒定。較好地解決了品種鑒定中各品種間親緣關(guān)系不清、品種繁雜無法區(qū)分的問題。對實現(xiàn)釀酒葡萄種質(zhì)資源管理、苗木早期純度鑒定、促進釀酒葡萄品種的保護以及指導(dǎo)實際生產(chǎn)均具有重要意義。