李東芹

摘要[目的]建立快速測定D-蟲熒光素的液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）分析方法，并對熒光素的碎裂機(jī)理進(jìn)行解析。[方法]采用Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，甲醇、水梯度洗脫12? min進(jìn)行色譜分離;在質(zhì)譜正離子模式下，用6對反應(yīng)監(jiān)測離子對（MRM）進(jìn)行定性、定量分析。[結(jié)果]目標(biāo)化合物在0.625～125.000 μg/L線性關(guān)系良好（r=0.996 9），檢出限為0.250 μg/L（S/N為5）。[結(jié)論]該方法靈敏度高、選擇性好，不僅可用于螢火蟲發(fā)光機(jī)理、發(fā)光強(qiáng)弱差異、發(fā)光顏色差異方面的研究，還可以用于其他需要定量測定熒光素的研究。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;快速分析;D-熒光素鉀鹽;螢火蟲;熒光素

中圖分類號 S-03文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0191-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.052

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract[Objective]A rapid high performance liquid chromatographymass spectrometry（HPLCMS/MS）method was developed for the determination of DLuciferin.The DLuciferin fragmentation mechanism was analyzed.[Method]The HPLC separation was carried on the shimpack VPODS column（150 L×2.0 mm，5 μm） with methanol and water eluting gradiently in 12? min.The DLuciferin was detected by using 6 multiple reaction monitoring （MRM） in ESI positive mode of mass spectrometer.[Result]There was a good linear relationship within the range of 0.625-125.000 μg/L（r=0.996 9）.The quantitative determination limit was 0.250 μg/L（S/N=5）.[Conclusion]The method is sensitive and selective. It can be used to detect DLuciferin rapidly in the firefly or other research .

Key words HPLCMS/MS;Rapid analysis;DLuciferin;Firefly;Luciferin

作者簡介 李東芹（1978—），女，安徽泗縣人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事大型儀器分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究。

收稿日期 2019-03-06

螢火蟲屬鞘翅目螢科，是螢科昆蟲的通稱，因其尾部能發(fā)出螢光，故名為螢火蟲。螢火蟲的發(fā)光是其體內(nèi)熒光素在熒光素酶催化下發(fā)生氧化反應(yīng)所釋放的能量形成的。不同品種、不同性別和不同生長時期的螢火蟲，其發(fā)光部位、發(fā)光強(qiáng)弱、發(fā)光顏色又有很大的差異[1-2]?，F(xiàn)有對螢火蟲發(fā)光機(jī)制的研究一般集中在熒光素酶的活性、穩(wěn)定性、立體結(jié)構(gòu)影響發(fā)光顏色等方面[3-7]，而對螢火蟲熒光素的研究非常少。除了少量螢火蟲熒光素人工合成[8-10]方法報(bào)道外，關(guān)于螢火蟲熒光素的定量測定方法鮮見報(bào)道。已報(bào)道的熒光素類物質(zhì)，如熒光素鈉、熒光黃、熒光桃紅等的測定方法有熒光分光光度計(jì)法[11]、拉曼光譜法[12]和高效液相色譜法[13-14]等，這些分析方法理論上也可以用于螢火蟲熒光素的測定，但是靈敏度和選擇性相對較差。筆者利用液相色譜質(zhì)譜高靈敏和高選擇性的特點(diǎn)，建立螢火蟲熒光素的定性、定量分析方法。

1 材料與方法

1.1? 試材 4000Qtrap 串聯(lián)三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）; LC-20AD高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;Milli-pore 超純水儀（美國Millipore公司）; 蠕動泵（Hamilton 公司）;離心機(jī)（貝克曼公司）。甲醇（色譜純，默克公司）;超純水; 乙酸（色譜純）;1 mL醫(yī)用注射器;022 μm微孔濾頭（上海安普）;D-蟲熒光素鉀鹽（上海前生生物有限公司）;穹宇螢樣品（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)付新華老師提供）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備。

精確稱取螢火蟲尾部組織，液氮研磨后加1 mL 95 ℃熱水勻漿萃取15 min，離心取上清500 μL，加500 μL正己烷，混勻后靜置分層，取下層水溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾頭過濾后上機(jī)分析。

1.2.2 儀器條件。

1.2.2.1 色譜條件。島津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，樣品室溫度為室溫;流動相：A為01%的乙酸水溶液，B為含2 mmol/L醋酸銨的甲醇溶液;流速為0.25 mL/min ，柱溫箱溫度為室溫，進(jìn)樣量為5 μL。梯度洗脫條件為：B∶A，0 min 為15∶85（V/V），5 min 為 100∶0（V/V），8 min 為100∶0（V/V），8.1 min為15∶85（V/V），12 min程序結(jié)束。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。采用電噴霧（ESI）離子源，在正離子電離模式下選用多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）掃描模式進(jìn)行定量分析。電噴霧電壓5 500 V;離子源溫度：500 ℃;離子源輔助氣GS1/GS2氣流均為50 L/h。質(zhì)量掃描范圍m/z 50～300，二級質(zhì)譜碰撞能量：31eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

用蠕動泵直接進(jìn)樣，對500 μg/L的熒光素鉀鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行母離子全掃描，在陽離子模式下得到熒光素鉀鹽的[（M-nK）+（n+1）H]型母離子為281.1;優(yōu)化電壓、離子源溫度和輔助氣等參數(shù)使分子離子峰最強(qiáng);在以上質(zhì)譜條件下，對選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，得到熒光素鉀鹽的二級質(zhì)譜碎片離子（圖1）;繼續(xù)對解簇電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口電壓（CXP）等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在DP為90 V、EP為10 V、CE為31 V、CXP為10 V條件下，熒光素的母離子、子離子信號強(qiáng)度比例適中;選取豐度最大的子離子235.2與母離子組成MRM定量離子對（281.10→235.2，選177.2、194.2、876、105.3、203.0 子離子與母離子組成5個輔助定性離子對。

2.2 熒光素的質(zhì)譜裂解方式

根據(jù)圖1熒光素在正離子模式下的離子碎片信息，推測可能存在以下3種主要的碎裂方式（圖2）。熒光素鉀鹽的準(zhǔn)分子離子峰[（M-nK）+（n+1）H]為m/z 281.1，脫去一個羧基后得到m/z 235.2的碎片離子;2位的碳氮鍵和4位的碳硫鍵同時斷裂，重排后可得到m/z為177.1 和105.3的碎片離子;1，3共軛雙鍵之間發(fā)生重排反應(yīng)后，4位的碳正離子不穩(wěn)定，碳氮鍵和5位的碳硫鍵繼續(xù)斷裂，重排后可得到m/z為87.2和194.1的離子碎片，這一步碎裂方式與文獻(xiàn)[15]結(jié)果一致。

2.3 螢火蟲樣品中熒光素的定性檢測

選取熒光素6個主要子離子碎片，組成6對MRM特征離子對，同時監(jiān)測這6個反應(yīng)，即m/z 281.1→235.2、194.2、177.2、105.3、87.2、203.0。若樣品中目標(biāo)化合物在每級反應(yīng)監(jiān)測過程中出峰并且保留時間相同，便可以確認(rèn)其存在。6對特征離子對幾乎全部蓋了D-蟲熒光素的所有碎裂途徑，定性結(jié)果準(zhǔn)確可靠。圖3為D-蟲熒光素鉀鹽標(biāo)準(zhǔn)品和雌螢火蟲中6對特征離子對的檢測結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)螢火蟲所含的熒光素結(jié)構(gòu)為D-蟲熒光素。

2.4 方法的靈敏度和特異性

將熒光素鉀鹽稀釋成1 mg/mL的母液，用超純水逐步稀釋成濃度為125.0、62.5、31.3、12.5、6.25 μg/L系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在“1.2.2”儀器條件下進(jìn)行上機(jī)分析。在MRM模式下選擇信號最靈敏的m/z 281.1→235.2為定量離子對，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)x、相應(yīng)的熒光素峰面積為縱坐標(biāo)y，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3 630x+4 870（r=0.996 9），表明目標(biāo)化合物在0.625～125.000 μg/L線性關(guān)系良好。在當(dāng)前試驗(yàn)條件下，方法的定量限為0.625 μg/L（S/N=10），檢出限為0.250 μg/L（S/N=5）。

只用單一離子對掃描檢測目標(biāo)成分時，有時會同時出現(xiàn)幾個色譜峰，如圖3中m/z 281.1→87.2 和m/z 281.1→105.3 這2個離子對，在標(biāo)樣和樣品中均出現(xiàn)幾個峰，此時就很難確定目標(biāo)成分峰。當(dāng)檢測指標(biāo)增加至6個離子對時，目標(biāo)成分就非常好辨認(rèn)。在每個MRM離子對譜圖（圖3）中，同一保留時間均出現(xiàn)的色譜峰只有一個，即是目標(biāo)成分。

2.5 實(shí)際樣品檢測

分別精確稱取穹宇螢的雌、雄、幼尾部組織，按照“1.2.1”方法處理后，在“1.2.2”儀器條件下上機(jī)測試，由外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量得到每100 g雌蟲、雄蟲和幼蟲的熒光素含量分別為362.69、725.00、13.76 μg。

3 結(jié)論

該研究建立的螢火蟲熒光素液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，有效避免了液相色譜法、分光光度法中基質(zhì)的干擾，具有快速、靈敏、選擇性高等特點(diǎn)。該方法不僅可以用于螢火蟲發(fā)光機(jī)理、發(fā)光強(qiáng)弱、發(fā)光顏色差異等方面的研究，也可用于蟲熒光素人工合成及其他研究中熒光素的定量分析。

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