甘文華，黃 凱，呂紫薇，高劭妍,2，蘇程程，李霄鶴,2，周紅剛,2

(1.南開大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、南開大學(xué)藥學(xué)院和天津市分子藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院高通量分子篩選中心，天津 300070；3. 中國人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心，天津 300162)

肺纖維化是一種死亡率高的肺部疾病，其特征是瘢痕形成，導(dǎo)致漸進(jìn)性和不可逆轉(zhuǎn)的肺泡結(jié)構(gòu)破壞。肺纖維化導(dǎo)致肺功能障礙、氣體交換困難、呼吸衰竭，最終引起死亡。特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是其中最為嚴(yán)重和最難治療的一種，IPF病因不明，確診后中位生存期僅為2-6年[1]。目前已上市的針對IPF的治療藥物有兩種：吡非尼酮(pirfenidone，PFD)和尼達(dá)尼布(nintedanib，NDN)。

PFD是一種吡啶酮化合物，2011年在歐盟被批準(zhǔn)用于治療成人輕至中度IPF，2014年在美國被批準(zhǔn)治療IPF[2]，同年在中國上市銷售。PFD抗肺纖維化的機(jī)制尚不完全清楚，動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其具有抗纖維化和抗炎作用[3-4]。NDN是一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，分別于2014、2015、2017年被美國FDA、歐盟EMA、中國CFDA批準(zhǔn)用于治療IPF[5]。NDN能夠通過抑制肺纖維化相關(guān)調(diào)控因子——血小板衍生生長因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)、血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)及成纖維生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)活性，緩解肺纖維化進(jìn)展[6]。

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)是肺纖維化進(jìn)展過程中重要的促纖維化細(xì)胞因子。肌成纖維細(xì)胞是肺纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，可合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)[7-8]。TGF-β和PDGF均可作用于肺成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移及產(chǎn)生ECM。TGF-β1可通過激活其下游Smad信號，促進(jìn)組織瘢痕形成和肺纖維化發(fā)生[9]。

因前期研究并未在同一實(shí)驗(yàn)體系中檢測兩個(gè)上市藥物的體外抗肺纖維化藥效，通過檢測吡非尼酮和尼達(dá)尼布對成纖維細(xì)胞增殖、遷移和活化的影響，可以更好地闡釋兩個(gè)上市藥物的機(jī)制，比較兩個(gè)上市藥物對肺纖維化關(guān)鍵指標(biāo)的影響程度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人胚肺成纖維細(xì)胞HFL1(ATCC)。

1.1.2藥物與試劑 吡非尼酮(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>98.5%)；尼達(dá)尼布(北京華威銳科化工有限公司，純度為99%)；F12K培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(康潤生物科技有限公司)；青霉素-鏈霉素溶液(Biosharp公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Life Science)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(碧云天生物技術(shù)有限公司)；TGF-β1、PDGF(美國PeproTech公司)；TRIzol試劑、DEPC-H2O(Life Technologies 公司)；氯仿、異丙醇、無水乙醇(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技有限公司)；qPCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、I型膠原蛋白(collagen 1，COL1)引物(泓迅生物科技有限公司)；α-SMA、FN、COL1一抗(Affinity Antibody公司)；p-Smad3抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(力康發(fā)展有限公司)；高速冷凍離心機(jī)、Multiskan Fc型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；熒光定量PCR儀(Roche)；電泳設(shè)備(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HFL1復(fù)蘇后，接種于含有10%胎牛血清和1‰雙抗(青霉素和鏈霉素)的F12K培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果，確定TGF-β1、PDGF刺激的最佳劑量分別為5 μg·L-1、10 μg·L-1。實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組、TGF-β1/PDGF組、吡非尼酮組、吡非尼酮+TGF-β1/PDGF組、尼達(dá)尼布組、尼達(dá)尼布+TGF-β1/PDGF組。

1.2.2MTT法檢測HFL1增殖 收集對數(shù)期細(xì)胞(細(xì)胞密度為80%左右)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，于96孔板中鋪板，密度為30%～40%,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細(xì)胞單層長至約80%，加入濃度梯度的吡非尼酮(0、0.625、1.25、2.5、5、10 mmol·L-1)或尼達(dá)尼布(0、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1)。孵育24 h，每孔加入15 μL濃度為5 g·L-1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h后，終止培養(yǎng)，每孔加入120 μL DMSO，在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔的吸光度值。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HFL1遷移 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，于24孔板中鋪板，密度為50%～60%，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細(xì)胞單層長至約80%，劃痕，更換無血清培養(yǎng)基，并加入吡非尼酮(1 mmol·L-1)、尼達(dá)尼布(2 μmol·L-1)，分別在加藥后0、12、24、48 h，于同一位置拍照。

1.2.4qPCR、Western blot檢測HFL1活化 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分別在12孔板和6孔板中鋪板，密度為50%～60%，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細(xì)胞單層長至約80%，更換0.1%血清培養(yǎng)基，饑餓處理24 h后，加入吡非尼酮(1 mmol·L-1)、尼達(dá)尼布(2 μmol·L-1)。分別提取細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行qPCR和Western blot，檢測α-SMA、FN、COL1、p-Smad3的表達(dá)，分析HFL1的活化程度。引物序列：α-SMA：F：5′-CTATGAGGGCTAT GCCTTGCC-3′，R：5′-GCTCAGCAGTAGTAACGAAG GA-3′；FN：F：5′-CGGTGGCTGTCAGTCAAAG-3′，R：5′-AAACCTCGGCTTCCTCCATAA-3′；COL1：F：5′-AG GGCAACAGCAGGTTCACTTACA-3′，R：5′-AGCGGG GGAAGGAGTTAATGAAAC-3′。

2 結(jié)果

2.1 吡非尼酮、尼達(dá)尼布對HFL1增殖的影響通過MTT實(shí)驗(yàn)比較吡非尼酮、尼達(dá)尼布對活化的肺成纖維細(xì)胞增殖的影響。Fig 1結(jié)果表明，吡非尼酮和尼達(dá)尼布均能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HFL1的增殖，尼達(dá)尼布作用效價(jià)高于吡非尼酮。

Fig 1 MTT results of pirfenidone(A) and nintedanib(B)

Fig 2 Scratch test results of TGF-β1 induced (A,B) and PDGF induced (C,D)

2.2 吡非尼酮、尼達(dá)尼布對HFL1遷移的影響根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇吡非尼酮作用濃度為1 mmol·L-1，尼達(dá)尼布作用濃度為2 μmol·L-1。通過劃痕實(shí)驗(yàn)，比較吡非尼酮、尼達(dá)尼布對活化的肺成纖維細(xì)胞遷移的影響。分別用TGF-β1、PDGF刺激HFL1，F(xiàn)ig 2結(jié)果表明，與模型組相比，吡非尼酮和尼達(dá)尼布均能抑制HFL1的遷移。TGF-β1刺激12 h時(shí)，尼達(dá)尼布與吡非尼酮效果相當(dāng)，TGF-β1刺激24、48 h時(shí)，尼達(dá)尼布效果強(qiáng)于吡非尼酮；PDGF刺激，尼達(dá)尼布效果強(qiáng)于吡非尼酮。

2.3 吡非尼酮、尼達(dá)尼布對HFL1活化和ECM分泌的影響

2.3.1qPCR檢測活化標(biāo)志物mRNA表達(dá) 通過檢測TGF-β1/PDGF刺激下各組細(xì)胞α-SMA、FN、COL1的表達(dá)，觀察吡非尼酮、尼達(dá)尼布對HFL1活化和ECM分泌的影響。TGF-β1/PDGF刺激下，模型組α-SMA、FN、COL1均明顯高于對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，吡非尼酮和尼達(dá)尼布均能抑制HFL1活化和ECM分泌。TGF-β1刺激下，吡非尼酮對α-SMA的抑制作用強(qiáng)于尼達(dá)尼布，尼達(dá)尼布對FN、COL1的抑制作用強(qiáng)于吡非尼酮；PDGF刺激下，吡非尼酮對α-SMA、COL1的抑制作用強(qiáng)于尼達(dá)尼布，對于FN的抑制，吡非尼酮和尼達(dá)尼布作用相當(dāng)(Fig 3)。

2.3.2Western blot檢測活化標(biāo)志物蛋白水平 在TGF-β1刺激下，模型組α-SMA、FN、COL1、p-Smad3蛋白表達(dá)量均高于對照組。結(jié)果表明，吡非尼酮和尼達(dá)尼布給藥組均能抑制活化標(biāo)志物α-SMA、FN、COL1的表達(dá)，且吡非尼酮和尼達(dá)尼布能夠通過抑制Smad3的磷酸化，抑制Smad3的活化，阻斷TGF-β/Smad3信號通路的激活，達(dá)到抗肺纖維化的作用，其中，尼達(dá)尼布對Smad3磷酸化的抑制作用強(qiáng)于吡非尼酮(Fig 4)。

3 討論

TGF-β和PDGF廣泛參與不同器官纖維化的發(fā)展，在IPF患者中均高表達(dá)，并且能夠促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、遷移、活化[9-10]。吡非尼酮和尼達(dá)尼布能夠明顯抑制TGF-β1和PDGF誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的增殖，且呈明顯劑量依賴性，尼達(dá)尼布低劑量抑制作用較吡非尼酮明顯；吡非尼酮和尼達(dá)尼布能夠明顯抑制TGF-β1和PDGF誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的遷移，尼達(dá)尼布抑制作用強(qiáng)于吡非尼酮；從實(shí)際臨床用藥劑量來看，尼達(dá)尼布最大劑量300 mg·d-1，吡非尼酮最大劑量1 800 mg·d-1，由于尼達(dá)尼布效價(jià)較高，低劑量給藥即可明顯抑制TGF-β1和PDGF誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。

Fig 3 qPCR results of markers under action of pirfenidone and nintedanib

Fig 4 Western blot results of various markers under action of pirfenidone and nintedanib

α-SMA陽性肺成纖維細(xì)胞在IPF患者肺部增加，并構(gòu)成成纖維細(xì)胞病灶的主體部分[11]。ECM沉積是造成肺纖維化的主要原因，F(xiàn)N、COL1是ECM的主要成分，F(xiàn)N、COL1過度沉積，會導(dǎo)致瘢痕形成，肺功能障礙，造成呼吸衰竭，并最終導(dǎo)致死亡。吡非尼酮和尼達(dá)尼布明顯降低TGF-β1和PDGF誘導(dǎo)的α-SMA、FN、COL1A2的mRNA水平，吡非尼酮對α-SMA mRNA的抑制作用較強(qiáng)，尼達(dá)尼布對FN、COL1A2 mRNA的抑制作用較強(qiáng)；吡非尼酮和尼達(dá)尼布能夠降低TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、FN、COL1的蛋白水平，尼達(dá)尼布對α-SMA蛋白表達(dá)的抑制作用與吡非尼酮相當(dāng)，對FN、COL1蛋白表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于吡非尼酮。

TGF-β被認(rèn)為是組織纖維化中的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過促進(jìn)下游纖維化相關(guān)靶基因過量表達(dá)，引起組織瘢痕[12]。與用博來霉素處理的野生型小鼠相比，敲除Smad3基因的小鼠能減少I型前膠原mRNA表達(dá)，降低肺中羥脯氨酸含量，從而改善肺纖維化[13]。吡非尼酮和尼達(dá)尼布能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3的磷酸化，吡非尼酮對Smad3磷酸化的抑制率為13%，尼達(dá)尼布對Smad3磷酸化的抑制率為51%。自噬能夠促進(jìn)膠原降解，在體外，TGF-β可劑量和時(shí)間依賴性地抑制肺成纖維細(xì)胞的自噬[14]。原代IPF肺成纖維細(xì)胞中，尼達(dá)尼布能夠通過Beclin-1途徑，促進(jìn)自噬改善肺纖維化[15]。尼達(dá)尼布改善肺纖維化機(jī)制之一可能是通過抑制TGF-β/Smad3信號通路促進(jìn)自噬，該機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，吡非尼酮和尼達(dá)尼布是目前臨床上治療IPF的藥物，吡非尼酮靶點(diǎn)未知，但其具有抗炎作用，并且可以通過影響TGF-β通路發(fā)揮抗纖維化作用。尼達(dá)尼布是一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，尼達(dá)尼布對TGF-β信號通路的抑制作用強(qiáng)于吡非尼酮。本研究首次在相同實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，比較吡非尼酮和尼達(dá)尼布對成纖維細(xì)胞增殖、遷移、活化、ECM和TGF-β信號通路的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尼達(dá)尼布優(yōu)于吡非尼酮。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在南開大學(xué)藥學(xué)院完成，在此對實(shí)驗(yàn)室的老師及同學(xué)表示衷心的感謝！)