刁俊玲，伍 敏，黃榮鳳，廖茂霖，陳春秀，，李佳渝，李繼斌，肖曉秋

(重慶醫(yī)科大學(xué)1. 附屬第一醫(yī)院重大代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重慶市高校重點實驗室、2. 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，易導(dǎo)致慢性腎衰竭，我國已進入DN發(fā)病的高發(fā)期[1-2]。腎臟纖維化是腎損傷的最終途徑，在腎小管上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)過程中，涉及了上皮細胞黏性的丟失，α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達增加，肌動蛋白重組，腎小管基底膜被破壞，以及細胞遷移和侵襲能力增強[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是促纖維化的關(guān)鍵因子。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)主要通過抑制在高糖條件下培養(yǎng)的腎小管細胞和糖尿病大鼠腎小管細胞中的TGF-β1/Smad3信號通路，進而減緩腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生[4]。

2型糖尿病是導(dǎo)致DN的主要原因[1]。經(jīng)典的噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinediones，TZDs)，如羅格列酮、吡格列酮等，作為口服治療2型糖尿病的主要藥物，在發(fā)揮治療作用的同時常伴隨較多嚴(yán)重的不良反應(yīng)[5]。通過對羅格列酮的結(jié)構(gòu)進行改造，我們合成了新型TZDs類PPARγ激動劑CMHX008(Fig 1),其對PPARγ的激動能力較羅格列酮弱，但具有與羅格列酮相似的胰島素增敏和促進脂肪細胞分化的作用[6]。Choi等[7]研究表明，在高脂條件下，小鼠脂肪細胞中細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5 (cyclindependent kinase 5，CDK5)介導(dǎo)的PPARγ的磷酸化明顯增加，抗糖尿病藥物羅格列酮通過抑制小鼠脂肪細胞中CDK5介導(dǎo)的PPARγ Ser273位點的磷酸化，來增加胰島素對葡萄糖的敏感性，進而發(fā)揮體內(nèi)維持正常葡萄糖水平的作用。研究發(fā)現(xiàn)，CMHX008可以抑制肥胖小鼠脂肪組織中PPARγ絲氨酸273位點的磷酸化，引起骨量丟失的程度較羅格列酮明顯減輕[8]，且對高脂飲食誘發(fā)的糖尿病小鼠的腎臟功能減退也有明顯的改善作用[9]。那么，在DN中，PPARγ部分激動劑CMHX008對腎臟功能的改善是否與PPARγ絲氨酸273位點的磷酸化有關(guān)。因此，本研究旨在將羅格列酮作為陽性對照，采用高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細胞為模型,闡明CMHX008對DN的改善作用與PPARγ絲氨酸273位點的磷酸化的關(guān)系。

1 材料

1.1 細胞與試劑人腎小管上皮細胞HK-2，購自中科院上海細胞所，按ATCC官網(wǎng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)。D-(+)-葡萄糖(Sigma，G7021)；D-甘露糖醇(Sigma，M1902)；Keratinocyte-SFM(Gibco，10725018)；牛腦垂體提取物(bovine pituitary extract，BPE)(Sciencell，0703)；重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor，rh-EGF)(Peprotech，96AF10015100)；羅格列酮(重慶太極集團)；CMHX008(專利號:201210202455.2)，由本校藥學(xué)院合成，純度99%；CCK-8試劑盒(日本同仁，CK04)；PPARγ(3025T)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體，均購自CST公司；p-PPARγ(上海戶實，HK-5769)；α-SMA(ab5694)、TGF-β1(ab64715)、Na+-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2(sodium-dependent glucose transporters 2，SGLT2，ab58298)抗體，均購自Abcam公司；β-actin抗體(Sino Biological，100166-MM10)；α-tubulin抗體(Proteintech，66031-1-1-lg)；TRIzol(Invitrogen，15996026)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche，7912455001)；SYBER(Roche，06924204001)；BD基底膜基質(zhì)膠(BD，356234)；小室(Millipore，MCEP24H48)。

Fig 1 The chemical structure of TZDs rosiglitazone and CMHX008

1.2 儀器1-15PK型低溫離心機(Sigma公司)；VERITI型梯度PCR儀(Applied Biosystems公司)；ND-2000型分光光度計、1510型全波長酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司)；CFX96型實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；DM40008型生物顯微鏡(Leica公司)；FUSION-FX5 Spectra型凝膠成像圖像分析系統(tǒng)(Vilber Lourmat 公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)HK-2細胞培養(yǎng)于Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基(含0.05 g·L-1BPE、5 μg·L-1EGF、0.9 mmol·L-1CaCl2、D-(+)-葡萄糖5.5 mmol·L-1)，放置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。采用0.05%胰酶消化，每5 d按1∶3比例傳代。將傳代細胞在5.5 mmol·L-1葡萄糖中培養(yǎng)作為空白對照組(Control組)；在30 mmol·L-1甘露醇中培養(yǎng)為高滲組(M組)；在30 mmol·L-1葡萄糖中培養(yǎng)為高糖組(HG組)；高糖培養(yǎng)基分別同時加入1、3、10 μmol·L-1羅格列酮或CMHX008處理作為HR1、HR3、HR10或HC1、HC3、HC10組。

2.2 CCK-8法檢測細胞活性取對數(shù)生長期的細胞，配制100 μL的細胞懸液，以5×103個/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h后，進行藥物處理，設(shè)置不含細胞和藥物的培養(yǎng)基組，含細胞的培養(yǎng)基組，高糖組(D-(+)-葡萄糖 30 mmol·L-1)，不同濃度的羅格列酮組(1、3、10 μmol·L-1)和CMHX008組(1、3、10 μmol·L-1)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中分別孵育24、48、72 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度。

2.3 免疫印跡法用已加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA常規(guī)裂解HK-2細胞，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，進行蛋白定量，取20 μL蛋白上樣，用SDS/PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，5% BSA常溫封閉2 h,用1∶1 000稀釋的一抗PPARγ、p-PPARγ、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、SGLT2、β-actin、α-tubulin 4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,顯影，結(jié)果用Fusion軟件進行分析。

2.4 實時熒光定量PCRTRIzol裂解液用于常規(guī)裂解HK-2細胞，提取總RNA，用分光光度計檢測RNA濃度。采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系于梯度PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄，并獲得模板cDNA，加入180 μL DEPC水，補齊至200 μL。取2.5 μL cDNA，加入5 μL SYBER、1.5 μL DEPC水、上下游引物各0.5 μL，補齊至10 μL，于qPCR儀中進行擴增。PCR擴增目的基因上、下游引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

2.5 劃痕實驗將HK-2細胞種于6孔板，在高糖條件下用羅格列酮和CMHX008處理7 d，待長到80%后，用200 μL槍頭在細胞底部輕輕劃上一條直線，用PBS輕洗2遍后，在倒置顯微鏡下采集0 h的圖像，采集完畢后，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后采集圖像。

2.6 Transwell實驗取25 μL Matrigel基底膜基質(zhì)膠用無血清K-SFM培養(yǎng)基梯度稀釋后混勻，取50 μL稀釋后的Matrigel膠加入小室后鋪勻，顯微鏡下觀察無氣泡,放入孵箱待成膠。過夜后，將用羅格列酮和CMHX008在高糖條件下處理7 d的HK-2細胞消化后，用無血清培養(yǎng)基制成1×109·L-1細胞懸液，在上室加入200 μL細胞懸液，下室加入750 μL完全培養(yǎng)基，將細胞放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后取出小室，用棉簽輕輕擦拭上室內(nèi)底面，擦掉未穿過膜的細胞，用PBS洗3次，多聚甲醛固定10 min后，結(jié)晶紫染液染色5 min，PBS洗3次，晾干后拍照。

3 結(jié)果

3.1 高糖條件下腎小管上皮細胞出現(xiàn)明顯的纖維化將HK-2細胞在30 mmol·L-1葡萄糖的高糖環(huán)境中培養(yǎng)7 d后，采用免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，高糖處理后HK-2細胞中TGF-β1的表達明顯增加，HK-2細胞顯示出明顯的纖維化，而采用等濃度的甘露醇處理的HK-2細胞中，TGF-β1的表達與空白對照組比較差異無顯著性(Fig 2)。通過檢測HK-2細胞中SGLT2和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter type 4，GLUT4)mRNA的水平,發(fā)現(xiàn)SGLT2、GLUT4 mRNA表達水平均明顯降低，HK-2細胞的纖維化引起腎小管上皮細胞膜轉(zhuǎn)運功能障礙(Fig 3)。在高糖條件下，檢測到HK-2細胞p-PPARγ(Ser273)增加，而采用等濃度的甘露醇處理的HK-2細胞與空白對照組比較，p-PPARγ(Ser273) 差異無顯著性(Fig 2)。以上結(jié)果表明，人腎小管上皮HK-2細胞在高糖環(huán)境中發(fā)生明顯的纖維化，腎小管上皮細胞的膜轉(zhuǎn)運功能明顯減弱，而PPARγSer273位點的磷酸化表達明顯增加。

3.2 羅格列酮和CMHX008能抑制高糖引起的腎小管上皮細胞纖維化的發(fā)生采用1、3、10 μmol·L-1的羅格列酮和CMHX008對HK-2細胞分別進行24、48、72 h的處理，通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，72 h后細胞活性顯示出明顯差異。如Fig 4所示，HR3組和HC3組(后面稱為HR、HC組)細胞存活率與對照組差異無顯著性，細胞狀態(tài)較為穩(wěn)定，因此，我們選用了3 μmol·L-1羅格列酮和3 μmol·L-1CMHX008進行高糖條件下的給藥處理。在30 mmol·L-1葡萄糖濃度下，分別給予3 μmol·L-1羅格列酮和CMHX008作用于HK-2細胞。如Fig 5所示，高糖條件下，纖維化標(biāo)志蛋白TGF-β1、α-SMA的表達明顯升高，E-cadherin表達明顯下降；給予PPARγ激動劑羅格列酮和CMHX008后，HK-2細胞中TGF-β1、α-SMA表達明顯降低，E-cadherin表達明顯升高。在高糖條件下，細胞的遷移能力和侵襲能力都明顯增強，而同時給予羅格列酮和CMHX008后，明顯抑制HK-2細胞的遷移和侵襲能力(Fig 6、7)。以上結(jié)果表明，羅格列酮和CMHX008對HK-2細胞的纖維化有明顯的抑制作用。有文獻表明[3]，纖維化會導(dǎo)致腎小管膜轉(zhuǎn)運功能障礙，引起SGLT2蛋白表達減少，因此，我們檢測了HK-2細胞中SGLT2蛋白，發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞中SGLT2明顯減少，而給予羅格列酮和CMHX008后，SGLT2蛋白的表達未明顯增加(Fig 5)。

Fig 2 Expression of TGF-β1,p-PPARγ(Ser273)and PPARγ protein levels in HK-2 cells cultured with high concentration of mannitol or glucose

Fig 3 Related mRNA expression levels in HK-2 cells cultured with high concentration of mannitol or glucose

Fig 4 Cell viability of different drug concentrations by CCK-8

Fig 5 Renal fibrogenic marker expression levels in HK-2 cells treated with drugs

3.3 羅格列酮和CMHX008下調(diào)HK-2細胞PPARγ Ser273位點的磷酸化羅格列酮和CMHX008可以逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞纖維化的發(fā)生，在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的HK-2細胞給予3 μmol·L-1羅格列酮和3 μmol·L-1CMHX008處理后，HR組和HC組p-PPARγ(Ser273)的表達明顯減少(Fig 8)。提示羅格列酮和CMHX008對腎小管上皮細胞纖維化的改善作用與抑制PPARγ Ser273位點磷酸化的上調(diào)有關(guān)。

4 討論

高血糖作為糖尿病的標(biāo)志，如果長期不加以控制，會對身體各器官造成損傷，甚至造成威脅生命健康的并發(fā)癥，如心血管疾病、神經(jīng)性疾病、眼病、腎病等。其中，糖尿病并發(fā)癥腎病的發(fā)生率不斷增加，影響了多數(shù)糖尿病患者[2]。DN的主要特征是腎臟功能的丟失，導(dǎo)致腎臟組織大面積的纖維化。據(jù)文獻報道，病理因素刺激的腎小管上皮細胞α-SMA呈時間依賴性遞增，上皮標(biāo)志蛋白如角蛋白表達等則逐漸減弱，至d 7時，α-SMA表達強度很高，而角蛋白等上皮細胞標(biāo)志蛋白的表達很弱或者消失[10]。高糖環(huán)境與腎小管的結(jié)構(gòu)和功能變化有密切聯(lián)系[3]。在本研究中，人腎小管上皮HK-2細胞在高糖環(huán)境下處理7 d后，纖維化標(biāo)志因子TGF-β1蛋白的表達明顯升高。GLUT4是受胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，在腎臟中有表達，而在實驗性糖尿病情況下表達會減少[11]。我們檢測發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下腎小管中GLUT4水平有明顯下調(diào)。

Fig 6 Migrated distance of HK-2 cells in four groups by wound healing assay vs control group;**P<0.01 vs group HG

Fig 7 Invaded ability of HK-2 cells in four groups by transwell assay vs control group;**P<0.01 vs group HG

Fig 8 The p-PPARγ(Ser273) protein expression levels of HK-2 cells treated by drugs

對于2型糖尿病的發(fā)生，如果改變生活方式不足以控制血糖，口服藥物如雙胍類、磺酰脲類、TZDs、SGLT2抑制劑等為治療2型糖尿病的主要途徑。其中，TZDs為2型糖尿病患者主要的口服降血糖藥物，但在臨床上出現(xiàn)較多嚴(yán)重不良反應(yīng),最常見的有水鈉潴留、體質(zhì)量增加、骨折風(fēng)險增加，以及羅格列酮心血管方面的影響等[5]。因此，研究者致力于研究較弱激動能力的PPARγ部分激動劑，如KY-201、SR1664，發(fā)現(xiàn)它們也具有與羅格列酮相似的胰島素增敏作用[12-13]。之前的研究已表明，化合物CMHX008不僅能有效維持肥胖小鼠體內(nèi)正常血糖穩(wěn)態(tài)，促進脂肪細胞的分化，而且相比羅格列酮，骨量的丟失明顯減少[6,8]。近年來，有文獻報道，在DN大鼠的腎臟中PPARγ表達的增加，抑制了發(fā)揮促纖維化關(guān)鍵基因如TGF-β1、膠原蛋白、纖黏蛋白的下調(diào)，PPARγ完全激動劑吡格列酮可以抑制在高糖條件下腎小管上皮細胞纖維化的發(fā)生，顯示出抗腎臟纖維化的作用[14-15]。因此，我們對具有較弱PPARγ激動能力的CMHX008化合物與DN的關(guān)系進行了研究。給予PPARγ激動劑羅格列酮和CMHX008處理后，高糖環(huán)境培養(yǎng)的HK-2細胞中纖維化標(biāo)志蛋白TGF-β1、α-SMA的表達明顯減少，E-cadherin蛋白表達明顯增加。結(jié)果表明，CMHX008對人腎小管上皮細胞纖維化的發(fā)生有明顯的抑制作用，CMHX008可以改善糖尿病患者腎臟的纖維化。

Choi等[7]在2010年提出，CDK5介導(dǎo)的PPARγ的磷酸化，是抗糖尿病PPARγ配體的直接靶標(biāo)，而PPARγ絲氨酸273位點的磷酸化，為脂肪生成和脂肪細胞基因表達的主要調(diào)節(jié)因素，減少胰島素敏化脂肪因子和脂聯(lián)素的表達,而羅格列酮可以阻斷CDK5介導(dǎo)PPARγ磷酸化的過程。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食的小鼠給予CMHX008后，小鼠脂肪細胞中PPARγ絲氨酸273位點的磷酸化明顯減少,骨量丟失明顯減少[8]。本實驗在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的HK-2細胞中發(fā)現(xiàn)，PPARγ絲氨酸273位點的磷酸化明顯增加，當(dāng)HK-2細胞在高糖條件下同時給予羅格列酮和CMHX008處理后，PPARγ蛋白絲氨酸273位點的磷酸化均明顯減少。高糖環(huán)境會誘發(fā)人腎小管上皮HK-2細胞PPARγ絲氨酸273位點磷酸化的上調(diào)，給予羅格列酮和CMHX008處理可以抑制PPARγ絲氨酸273位點的磷酸化。

雖然PPARγ激動劑羅格列酮可促進脂肪的分化，增強外周組織對胰島素的敏感性，但是由于其不良反應(yīng)限制了在臨床中的使用，而CMHX008具有類似的胰島素增敏作用，并且已證明可以減少骨量的丟失，不引起體質(zhì)量的增加[6,8]。因此，本研究旨在以糖尿病的高糖環(huán)境為誘發(fā)DN的主要因素，發(fā)現(xiàn)了激動能力較弱的PPARγ激動劑CMHX008可以減少人腎小管上皮細胞的纖維化，對腎臟有明顯的保護作用，其與PPARγ絲氨酸273位點磷酸化的抑制有關(guān)。DN為普通糖尿病人群主要的并發(fā)癥，有效避免治療糖尿病的藥物所帶來的不良反應(yīng)是預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的主要途徑，這一發(fā)現(xiàn)為未來CMHX008用于預(yù)防DN的發(fā)生、糖尿病并發(fā)腎臟疾病的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。