姜壯壯，徐婷婷，陶 麗，劉延慶

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，國(guó)家中醫(yī)管理局胃癌毒邪論治重點(diǎn)研究室，揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)藥研究所，揚(yáng)州大學(xué)腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225001)

鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)的突變是許多腫瘤如結(jié)腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等常見的生物學(xué)事件，也是很多腫瘤發(fā)病的主要機(jī)制之一。KRAS基因突變可導(dǎo)致機(jī)體失去GTP水解酶活性, 其致癌作用主要是影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。同時(shí)，KRAS突變遺傳背景具有異質(zhì)性, 對(duì)于KRAS基因突變治療的藥物研究迫在眉睫。本文就目前針對(duì)腫瘤KRAS基因突變的靶向治療的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為KRAS突變腫瘤治療提供最新線索。

1 KRAS基因

RAS是人類基因中重要的原癌基因之一，被認(rèn)為是控制細(xì)胞基本功能的鳥苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase，GTPases)大型家族的創(chuàng)始成員，也是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號(hào)通路上的重要靶點(diǎn)。其家族基因主要有3種，分別是KRAS、NRAS和HRAS。其中，KRAS基因突變對(duì)人類癌癥的影響最為深刻，KRAS基因的突變?cè)谌祟惏┌Y中相當(dāng)常見，占所有人類癌癥的17%～25%[1]。自1982年KRAS作為一種致癌基因首次被發(fā)現(xiàn)以來，人們一直在努力開發(fā)針對(duì)KRAS突變腫瘤的靶向治療。

KRAS基因編碼的產(chǎn)物為一種被稱為P21小G蛋白，具有GTP酶活性，在GTP和GDP結(jié)合轉(zhuǎn)換之間發(fā)揮分子開關(guān)作用。RAS蛋白結(jié)合GDP通過鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEFs)轉(zhuǎn)換為GTP，從而使RAS激活[2]。KRAS蛋白控制細(xì)胞質(zhì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能。熱點(diǎn)突變的位置通常發(fā)生在第12和13位密碼子上(Fig 1)。突變后的KRAS通過細(xì)胞表面受體影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使原本的GTP結(jié)合狀態(tài)通過喪失內(nèi)在的催化活性或者是通過GTPase喪失而最終激活蛋白，并啟動(dòng)復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，持續(xù)激活下游RAS-RAF-MEK-MAPK細(xì)胞信號(hào)通路。此外，KRAS也是其他許多信號(hào)通路的關(guān)鍵激活因子，導(dǎo)致明顯的生物學(xué)效應(yīng)。例如，磷脂酰肌醇激酶(phosphate-3 kinase，PI3K)和Ral蛋白都是KRAS的下游效應(yīng)物，在生物學(xué)功能上誘導(dǎo)細(xì)胞的過度繁殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，以及血管生成和細(xì)胞凋亡等一系列腫瘤病理變化，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[3]。KRAS網(wǎng)絡(luò)及其下游通路之間的相互作用的復(fù)雜性，使得KRAS基因突變蛋白難以通過傳統(tǒng)手段抑制其活性，同時(shí)，KRAS對(duì)GDP和GTP酶的固有高親和性以及蛋白質(zhì)表面缺乏明確的藥物位點(diǎn)[4]，多年來在癌癥基因組領(lǐng)域被稱為“癌基因的珠穆朗瑪峰”。

Fig 1 KRAS hotspot mutation site

目前，大規(guī)模的臨床研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因點(diǎn)突變?cè)谝认侔┲邪l(fā)生頻率最高，約有90%的胰腺癌患者具有至少1種KRAS基因的點(diǎn)突變；在結(jié)直腸癌發(fā)生的初始階段，約有34.2%～52.7%的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者中可以檢測(cè)到突變型KRAS基因[5]。在非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的KRAS突變中，KRAS基因的突變率在東方人群和西方人種中具有較大差異，是西方人種最常見的突變基因，突變率接近30%[6]。KRAS突變腫瘤仍然是一種高度未被滿足臨床需要的疾病，三十多年來，對(duì)KRAS基因突變藥物研究的步伐從未停滯。研究發(fā)現(xiàn)，靶向藥物具有激活免疫反應(yīng)的作用, 靶向治療結(jié)合免疫治療可以有效縮短免疫治療響應(yīng)周期, 而免疫治療提高了機(jī)體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng), 也有利于靶向藥物發(fā)揮作用[7]。研究者們主要從KRAS的基因水平、蛋白水平、功能水平的抑制，以及聯(lián)合用藥和協(xié)同致死等方面，進(jìn)行多方面的深入研究(Fig 2)。

Fig 2 Targeted strategies for inhibiting KRAS function in different stages

2 KRAS基因突變藥物治療進(jìn)展

2.1 抑制KRAS轉(zhuǎn)錄調(diào)控下調(diào)KRAS表達(dá)KRAS的表達(dá)受多種微小RNA的直接調(diào)控。KRAS已知是miR-200c(一種小RNA抑制劑)的直接靶點(diǎn)，參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重構(gòu)的基因調(diào)控因子。過表達(dá)miR-200c可降低KRAS基因的表達(dá)。其下游的磷酸化Akt與ERK通路也發(fā)生了相應(yīng)的下調(diào)，膀胱癌細(xì)胞的增殖能力也發(fā)生了明顯的抑制[8]。Sun等[9]證明，miR-202能靶向非小細(xì)胞肺癌中的KRAS，過表達(dá)miR-202可以抑制RAS/MAPK通路活性水平，此外，miR-202表達(dá)水平的恢復(fù)可以提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。

2.2 利用siRNA干擾技術(shù)干擾KRAS突變干擾KRAS已經(jīng)被證明在控制胰腺癌細(xì)胞系增殖方面是有效的，目前Khvalevsky等[10]研發(fā)了一種傳遞系統(tǒng)LODER，使siRNA(siG12D LODER)能夠干擾抵抗突變的KRAS。對(duì)siG12D LODER進(jìn)行了體外和體內(nèi)結(jié)構(gòu)、釋放和傳遞特性的評(píng)估。在原位小鼠模型中，評(píng)估了siG12D LODER對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。進(jìn)一步評(píng)估KRAS沉默對(duì)KRAS下游信號(hào)通路的影響。研究還發(fā)現(xiàn)，LODER包封的siRNA可在體內(nèi)存活155 d，且穩(wěn)定活躍。siG12D LODER處理胰腺癌細(xì)胞株后，KRAS表達(dá)水平明顯下降，抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖和上皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化。在體內(nèi)，siG12D LODER可以抑制胰腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。納米顆粒載體作為有效siRNA傳遞的潛在候選載體具有以下優(yōu)點(diǎn):① siRNA不容易被降解;② siRNA在腫瘤內(nèi)局部緩慢釋放，作用持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng);③ siG12D LODER具有治療作用，不會(huì)導(dǎo)致任何局部或全身的副作用[11]。

2.3 基于反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)的抑制KRAS策略Ross等[12]使用基因療法，描述了AZD4785的臨床前評(píng)估，這是一種高親和力約束的含乙基的反義寡核苷酸靶向KRAS mRNA。AZD4785細(xì)胞中KRAS的mRNA和蛋白高效地、有選擇地耗盡，導(dǎo)致KRAS突變細(xì)胞下游效應(yīng)通路的抑制和有選擇地抗增殖作用。AZD4785介導(dǎo)的KRAS的缺失與MAPK通路的反饋激活無關(guān)，而RAS-MAPK通路則與此相關(guān)。全身給予AZD4785可有效地抑制KRAS在腫瘤中的表達(dá)和抗腫瘤活性，展示了一種反義寡核苷酸抑制KRAS的療法。研究中使用的反義寡核苷酸經(jīng)過化學(xué)修飾，允許通過皮下注射進(jìn)行全身輸送，避免使用專門的運(yùn)載工具。Ross等[12]在多只非小細(xì)胞肺癌模型小鼠上測(cè)試了這種療法的有效性，并評(píng)估了它在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的安全性，證明了它在人類的潛在適用性。

2.4 抑制KRAS基因突變體酶活性水平更多的研究者開始將他們的目光放在針對(duì)KRAS基因突變體蛋白靶向的小分子藥物的研究中。如Ostrem等[13]發(fā)現(xiàn)了一種KRASG12C突變體特異性抑制劑，該抑制劑能有效抑制KRASG12C突變體和GTP結(jié)合，促進(jìn)其與GDP的結(jié)合，阻止了后續(xù)下游信號(hào)的活化。Lim等[14]報(bào)道了另外一種KRASG12C抑制劑，在不影響正常KRAS的情況下，特異性結(jié)合突變的KRAS基因，共價(jià)抑制劑KRASp.G12C等位基因能夠?qū)ν蛔兊腒RAS進(jìn)行直接和特異性的抑制，使突變的KRAS失去活性。最近，一種針對(duì)KRASG12C變構(gòu)開關(guān)Ⅱ口袋的新型細(xì)胞活性和突變特異性抑制劑，顯示出更強(qiáng)的效率和選擇性，進(jìn)一步揭示了KRASG12C快速循環(huán)其核苷酸底物[15]。KRASG12C選擇性抑制劑的開發(fā)開啟了一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，它改變了RAS蛋白從不耐藥到耐藥的認(rèn)知。最近在RAS與RAF和其他效應(yīng)蛋白的結(jié)合中，發(fā)現(xiàn)了新的RAS模擬小分子藥物Rigosertib，用于KRAS突變體的腫瘤的治療[16-17]。

2.5 KRAS蛋白降解調(diào)節(jié)劑LZTR1是一個(gè)與人類疾病有關(guān)的新型RAS調(diào)節(jié)劑，關(guān)于RAS調(diào)節(jié)的替代機(jī)制將導(dǎo)致人們開發(fā)出治療RAS驅(qū)動(dòng)疾病的新型治療方法。M. Steklov等[18]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性人LZTR1與主要RAS同種型結(jié)合。LZTR1介導(dǎo)的RAS在K170位點(diǎn)泛素化抑制了RAS-MAPK信號(hào)通路。該研究結(jié)果為L(zhǎng)ZTR1參與多種遺傳性和獲得性人類疾病提供了分子基礎(chǔ)，LZTR1介導(dǎo)的RAS在K170上的泛素化調(diào)控RAS活性，而RAS活性的失調(diào)導(dǎo)致了人類疾病的發(fā)生。一項(xiàng)相關(guān)研究表明，LZTR1失調(diào)也會(huì)導(dǎo)致耐藥性。了解這種非傳統(tǒng)的RAS激活機(jī)制可能有助于確定哪些患者可能受益于RAS通路抑制劑，并為這些患者提供新的治療方法。

2.6 阻斷KARS下游的信號(hào)通路KRAS下游主要包括PI3K信號(hào)通路。PI3K是KRAS基因通路下游的一個(gè)重要的效應(yīng)分子之一，PI3K信號(hào)通路以PI3K-Akt-mTOR通路為主，參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等各種細(xì)胞過程。近年來，針對(duì)PI3K-mTOR雙重靶向抑制劑，如BEZ-235(一種新型咪唑并喹啉衍生物)用于治療晚期乳腺癌和實(shí)體瘤，臨床上顯示該藥物治療不僅可以大大降低耐藥性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑、吉西他濱、長(zhǎng)春新堿等細(xì)胞毒性藥物的敏感性，還能維持糖代謝穩(wěn)定[19]。

2.7 KRAS基因上游信號(hào)通路抑制劑KRAS是EGFR的下游效應(yīng)物。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，伴有KRAS突變的腫瘤對(duì)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)具有耐藥性，研究發(fā)現(xiàn)[20]，由于KRAS基因的突變可以直接啟動(dòng)EGF通路下游的KRAS途徑,并間接啟動(dòng)了EGF信號(hào)通路中的PI3K途徑，使得第1代酪氨酸激酶抑制劑埃羅替尼和吉非替尼對(duì)KRAS突變引起的非小細(xì)胞肺癌治療無效。曲米替尼(Tram，GSK1120212)是一種新的MEK抑制劑，通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)可有效抑制RAS信號(hào)通路。

2.8 聯(lián)合用藥與協(xié)同致死采用曲米替尼和EGFR抑制劑組合的協(xié)同作用于KRAS突變型肺癌和胰腺癌細(xì)胞，這些結(jié)果與單獨(dú)使用MEK抑制劑曲米替尼后FRS2磷酸化增強(qiáng)密切相關(guān)，即抑制FGFR可增強(qiáng)曲米替尼的作用。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，靶向特定的RTK(如FGFR1)比靶向多效應(yīng)因子(如AKT29)更容易耐受，并為進(jìn)一步開發(fā)出更具特異性的FGFR1拮抗劑提供理論依據(jù)[21]。Dai等[22]發(fā)現(xiàn)，Tram治療引起了RAS上游的反饋激活，誘導(dǎo)KRAS突變腫瘤中磷酸化MEK和磷酸化ERK的反彈。這種ERK持續(xù)抑制的失敗導(dǎo)致了耐藥性。唑來膦酸(ZA)是一種含氮雙膦酸鹽，通過抑制RAS基因的異戊二烯?；茐腞AS基因的生物活性。ZA通過甲戊酸鈉通路增強(qiáng)了Tram的作用，可能代表一種治療KRAS突變型癌癥的新策略，從而克服了耐藥性問題。瑞格非尼是一種口服多激酶抑制劑，其主要靶向抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路中的RTKs，通過該聯(lián)合用藥可有效阻斷Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路。對(duì)于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸患者，采用瑞格非尼和福爾菲利聯(lián)合應(yīng)用，臨床上取得了良好的療效[23]。

KRAS突變基因的協(xié)同致死策略雖具有挑戰(zhàn)性和艱難性，但仍是有希望的治療方案。在26個(gè)結(jié)直腸癌和胰腺癌模型組中，證實(shí)了KRAS突變基因協(xié)同細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)合成致死適用于具有氨基酸位置12(p.G12V、pG12D、p.G12S)或氨基酸位置13(p.G13D)KRAS突變的腫瘤細(xì)胞。從機(jī)制上講，CDK1抑制導(dǎo)致KRAS突變細(xì)胞的S期分?jǐn)?shù)降低，這種作用的特點(diǎn)在于調(diào)節(jié)Rb，即G1/S檢查點(diǎn)。總之，這些觀察結(jié)果表明，KRAS/CDK1相互作用是一種強(qiáng)大的合成致死效應(yīng)[24]。Sharaf等[25]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合益生菌和塞來昔布同時(shí)使用治療持續(xù)18周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種組合方法可能降低腫瘤負(fù)擔(dān)，減少腫瘤的多樣性，降低抗凋亡Bcl-2、原癌基因KRAS的表達(dá)，上調(diào)促凋亡Bax和抑癌因子p53的表達(dá)。

3 總結(jié)與展望

總的來說，KRAS靶向治療藥物的一個(gè)重要問題是，這些藥物是否需要對(duì)KRAS的突變形式進(jìn)行特異性的抑制，或者非選擇性對(duì)KRAS的突變型和野生型的抑制是否具有預(yù)期的抗腫瘤活性和必要的安全性，是評(píng)價(jià)能否成為有價(jià)值的靶向抗癌藥的指標(biāo)。抑制RAS基因的最佳途徑還有待確定，因?yàn)檫@些藥物通過直接靶向RAS蛋白或RAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式在進(jìn)入臨床前還有很長(zhǎng)的路要走。