梁瑩瑩，王 欣，劉 芹，王 丁，杜小雷，李潤濤，蔣益民，葉 加

(北京大學 1. 藥學院分子與細胞藥理學系、 2. 藥學院化學生物學系、 3. 醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心，北京 100191)

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病直接造成的疼痛，其基本特征為自發(fā)性疼痛、觸摸痛及痛覺過敏。流行病學研究顯示，神經(jīng)病理性疼痛的患病率約在6.9%～10%[1]。全世界數(shù)以百萬計的患者遭受神經(jīng)病理性疼痛的痛苦，嚴重影響患者的生活質量。

螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物是以季銨鹽類煙堿受體激動劑1，1二甲基4苯基哌嗪碘化物(1，1-dimethy1-4-phenylpiperazineiodide,DMPP)和抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺為基礎，進行結構改造而成的一類具有知識產(chǎn)權的新型化合物，研究顯示[2-3]，其有明顯的緩解急性疼痛和炎癥作用。在此基礎上，對有效化合物的結構進一步優(yōu)化、改進，得到螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物DXL-A-22(Fig 1)。目前尚未有關于螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物DXL-A-22抗神經(jīng)病理性疼痛作用及機制的報道。本文擬研究化合物DXL-A-22抗神經(jīng)病理性疼痛作用，探討其可能的抗神經(jīng)病理性疼痛作用機制，為研發(fā)高效低毒的抗神經(jīng)病理性疼痛藥物提供實驗依據(jù)。

Fig 1 Chemical structure of spirocyclopiperazinium salt compound DXL-A-22

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠，體質量(200～250) g，♀♂各半，由北京大學實驗動物部提供，許可證號：SCXK(京)2016-0010；動物飼養(yǎng)于標準環(huán)境：溫度(22±0.5)℃，相對濕度(55±5)%，人工光照，12 h明暗周期，自由飲食、飲水。所有實驗符合國際疼痛研究協(xié)會研究與倫理問題委員會的標準，均采用盲法測定。

1.2 藥物與試劑螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物DXL-A-22(純度95%以上，由李潤濤教授課題組合成提供)；加巴噴丁(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：20141028)；RIPA裂解液(P0013B，北京碧云天生物科技有限公司)；蛋白酶抑制劑(P1265-1)、蛋白磷酸酶抑制劑(P1260-1)、BCA蛋白檢測試劑盒(P1511-1)，均購自北京普利萊基因技術有限公司；ECL發(fā)光液(ZS-20480)、β-actin抗體(TA-09)，購自北京中杉金橋生物科技有限公司；磷酸化鈣調蛋白激酶Ⅱα(phospho-calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱα，p-CaMKⅡα)，(ab124880)、CaMKⅡα(ab92332)，購自美國Abcam公司；抗體磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(phospho-cAMP response element-binding protein，p-CREB，9198S)、CREB(9197S)、磷酸化JAK2(phospho-Janus kinase 2，p-JAK2，3776S)、JAK2(3230S)、磷酸化信號傳導及轉錄激活因子3(phospho-signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3，9145S)、STAT3(4904S)，均購自美國Cell Signaling Technology；TRIzol試劑(MN012)、cDNA反轉錄試劑盒(4368814)、SYBR Select Master Mix(4472908)，均購自美國Invitrogen公司；Go Taq qPCR Master Mix(A6001，美國Promega)。

1.3 儀器IITC 2390型Von Frey電子測痛儀(美國IITC公司)；LE 7406熱痛反應測量儀(西班牙Panlab公司)；3K15離心機(美國Sigma公司)；電泳儀、電轉儀、iMark酶標儀、ChemiDoc XRS System高靈敏化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；9700 PCR擴增儀(美國Applied Biosystem公司)；MX3005P熒光實時定量分析系統(tǒng)(美國安捷倫公司)。

1.4 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)模型坐骨神經(jīng)CCI模型參考Bennett等[4]1988年描述的模型稍作改動。具體操作如下：大鼠用戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1，i.p.)麻醉后，大腿右邊手術部位去毛，俯臥位固定，沿大鼠右后肢股骨中部縱向切口，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)分叉處近端用4-0絲線松結扎4次，每次間隔約1 mm，松緊程度以觀察到右后腿稍微抖動為宜。結扎后依次縫合肌肉和皮膚，假手術組只暴露坐骨神經(jīng)，但不結扎。通過觀察術后大鼠術側后肢是否出現(xiàn)足趾并攏，輕微外翻，經(jīng)常處于騰空狀態(tài)，是否有舔、咬或激烈抖動手術側足跖，以及測定大鼠機械刺激縮足反應閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱刺激縮足潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)，判斷造模是否成功。

術前測定大鼠機械刺激縮足反應閾值和熱刺激縮足潛伏期，以此分組，每組8只：假手術組(雙蒸水，distilled water，DDW，i.g)，溶媒組(DDW，i.g.)，DXL-A-22組(2、1、0.5 mg·kg-1，i.g.)和加巴噴丁組(gabapetin，100 mg·kg-1，i.g.)，術后d 1給藥前測痛閾，剔除模型異常的動物，確認造模成功后開始給藥[5]。從術后d 1開始每天灌胃給予大鼠DDW，DXL-A-22或加巴噴丁。陽性對照加巴噴丁是目前臨床常用的治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物，同時也是國內外文獻常用的陽性對照藥物，劑量參考國內外相關文獻，并通過預實驗確認[6]。

1.4.1大鼠MWT的測定 大鼠MWT用Von Frey電子測痛儀測定。術前1 d和術后1、3、5、7、9、11、14 d灌胃給予DDW、DXL-A-22或加巴噴丁后2 h測定。將大鼠置于透明有機玻璃箱(底部是空隙20 mm2的鐵絲網(wǎng))中適應環(huán)境30 min，待大鼠無探索動作后，用Von Frey電子測痛儀探針刺激大鼠術側足跖位置，測痛儀自動記錄引起大鼠縮足反應的最大作用力即MWT。大鼠機械刺激痛閾提高率%(the percentage of pain threshold elevation，PTE%)用下列公式計算：PTE/%=[(實驗組MWT-溶媒組MWT)/溶媒組MWT]×100。

1.4.2大鼠PWL的測定 用熱板法測定大鼠PWL。術前1 d和術后1、3、5、7、9、11、14 d灌胃給予DDW、DXL-A-22或加巴噴丁后2 h測定。熱板溫度為50.5 ℃，從大鼠置于熱板儀開始計時，到大鼠出現(xiàn)抖、舔足反應停止計時，此時間即為大鼠PWL。熱板切斷時間為14 s，最大鎮(zhèn)痛百分率%(the percentage of maximal possible effect，MPE%)用下列公式計算：MPE/%=[(實驗組PWL-溶媒組PWL)/(切斷時間-溶媒組PWL)]×100。

1.5 Western blot大鼠隨機分為3組：假手術組(DDW，i.g)、溶媒組(DDW，i.g.)和DXL-A-22組(2 mg·kg-1，i.g.)，每組6只。坐骨神經(jīng)結扎后，每天給予DDW或化合物DXL-A-22。CCI術后d 7，給予DDW或化合物DXL-A-22 2 h后，大鼠用乙醚麻醉，脫頸處死，提取損傷側L4、L5背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)。提取的DRG組織用9倍體積的RIPA裂解液裂解，研磨后的溶解產(chǎn)物于4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清。用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。上清加loading buffer，95 ℃高溫變性5 min，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆?。采用SDS-PAGE膠分離蛋白樣品，恒壓電泳。以濕轉法將蛋白轉至PVDF膜，恒流電轉。轉膜后將目的蛋白條帶用50 g·L-1脫脂奶粉封閉，搖床室溫1 h，然后孵育一抗p-CaMKⅡα、CaMKⅡα、p-CREB、CREB、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-actin，搖床4 ℃孵育過夜。PVDF膜在TBST封閉洗滌液中洗3次，每次10 min。用辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST封閉洗滌液洗3次，每次10 min。加ECL發(fā)光劑，用高靈敏化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)檢測。以Quantity One軟件計算目的蛋白條帶的灰度值?；衔顳XL-A-22對蛋白表達的抑制率%用下式計算：抑制率/%=[(溶媒組蛋白表達量-實驗組蛋白表達量)/溶媒組蛋白表達量]×100。

1.6 qPCR動物分組與組織提取同“1.5”。取DRG和脊髓加TRIzol試劑，充分研磨，勻漿后轉至EP管，室溫5 min。加氯仿，震蕩15 s，顛倒混勻10下，充分混勻后，室溫放置3 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。取上層水相于EP管中，加異丙醇，顛倒混勻，室溫10 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。棄上清，得白色沉淀。加乙醇，吹打混勻，4 ℃、7 500×g離心5 min。棄上清，重復上一步驟。得白色沉淀，干燥10 min，加無核酸酶的水，金屬浴，60 ℃，15 min，即得mRNA溶液。用紫外分光光度計法測溶液在260 nm處的吸光度，得mRNA溶液濃度。根據(jù)mRNA濃度，取2 μg mRNA。cDNA的合成使用cDNA反轉錄試劑盒，通過PCR擴增儀完成。反轉錄條件：25 ℃，10 min；37 ℃，120 min ；85 ℃，5 min。得cDNA分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆?。實時定量PCR通過熒光實時定量分析系統(tǒng)完成反應過程。實時定量PCR反應條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，2 min；(95 ℃，15 s；58 ℃，15 s；72 ℃，1 min)40個循環(huán)。引物序列見Tab 1。通過循環(huán)擴增數(shù)(2-ΔΔCT)方法計算?；衔顳XL-A-22對TNF-α、c-Fos mRNA表達的抑制率按下式計算：抑制率/%=[(溶媒組2-ΔΔCT值-實驗組2-ΔΔCT值)/溶媒組2-ΔΔCT值]×100。

Tab 1 PCR primer sequence

1.7 急性毒性試驗急性毒性試驗根據(jù)經(jīng)濟合作和發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)指導方案第423條建立[7]。小鼠(n=10)灌胃給予化合物DXL-A-22(1 000 mg·kg-1，i.g.)，觀察小鼠在72 h內(每3 h觀察1次)的行為，自主活動，任何致命性，殺傷力的狀態(tài)或死亡現(xiàn)象，共觀察14 d。

2 結果

2.1 化合物DXL-A-22抗大鼠神經(jīng)病理性疼痛作用

2.1.1化合物DXL-A-22對CCI大鼠MWT的影響 如Fig 2所示，坐骨神經(jīng)結扎術后1～14 d，溶媒組大鼠術側MWT與假手術組比較明顯降低(P<0.01)?；衔顳XL-A-22(2、1、0.5 mg·kg-1，i.g.)劑量依賴性提高MWT，與溶媒組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。術后1、3、5、7、9、11、14 d，DXL-A-22大劑量組痛閾提高率(PTE%)分別為58%、80%、95%、108%、91%、95%和97%，中劑量組PTE%分別為40%、59%、69%、86%、63%、60%和68%，小劑量組PTE%分別為35%、41%、57%、71%、54%、53%和58%，陽性對照加巴噴丁(100 mg·kg-1，i.g.)PTE%分別為66%、83%、98%、118%、95%、96%和103%。大劑量化合物DXL-A-22的痛閾提高率與加巴噴丁(100 mg·kg-1，i.g.)比較差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 2 Effect of DXL-A-22 on mechanical withdrawal threshold

2.1.2化合物DXL-A-22對CCI大鼠PWL的影響 如Fig 3所示，坐骨神經(jīng)結扎術后1～14 d，溶媒組大鼠熱刺激縮足潛伏期(PWL)與假手術組比較明顯降低(P<0.01)。化合物DXL-A-22(2，1，0.5 mg·kg-1，i.g.)劑量依賴性提高大鼠PWL，與溶媒組比較有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。術后1、3、5、7、9、11、14 d，DXL-A-22大劑量組最大鎮(zhèn)痛百分率(MPE%)分別為38%、57%、62%、77%、68%、63%和65%，中劑量組MPE%分別為29%、44%、47%、56%、54%、53%和50%，小劑量組MPE%分別為24%、38%、40%、43%、42%、39%和38%，陽性對照加巴噴丁(100 mg·kg-1，i.g.)最大鎮(zhèn)痛百分率分別為41%、59%、65%、82%、75%、78%和79%。大劑量化合物DXL-A-22的最大鎮(zhèn)痛百分率與加巴噴丁(100 mg·kg-1，i.g.)比較差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 3 Effect of DXL-A-22 on paw withdrawal latency

2.2 化合物DXL-A-22抗神經(jīng)病理性疼痛作用機制

2.2.1化合物DXL-A-22對CCI大鼠DRG p-CaMKⅡα/p-CREB蛋白表達的影響 如Fig 4所示，坐骨神經(jīng)結扎術引起溶媒組大鼠DRG中p-CaMKⅡα和p-CREB蛋白表達明顯增加，與假手術組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。術后次日連續(xù)給予化合物DXL-A-22(2 mg·kg-1，i.g.)7 d，p-CaMKⅡα和p-CREB蛋白表達與溶媒組比較明顯降低(P<0.05)，抑制率分別為37%和48%，與假手術組比較差異無顯著性(P>0.05)。各組間CaMKⅡα、CREB蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)。

2.2.2化合物DXL-A-22對CCI大鼠DRG p-JAK2/ p-STAT3蛋白表達的影響 如Fig 5所示，坐骨神經(jīng)結扎術后，溶媒組大鼠DRG中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達明顯升高，與假手術組比較差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。連續(xù)給予化合物DXL-A-22(2 mg·kg-1，i.g.)7 d，明顯降低DRG中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(P<0.05)，抑制率分別為35%和58%,與假手術組比較差異無顯著性(P<0.05)。各組間JAK2、STAT3蛋白表達保持穩(wěn)定(P<0.05)。

2.2.3化合物DXL-A-22對CCI大鼠DRG和脊髓中TNF-α mRNA、c-fos mRNA表達的影響 如Fig 6所示，CCI術后，溶媒組大鼠DRG和脊髓TNF-α、c-Fos mRNA表達明顯增加，與假手術組比較差異有顯著性(P<0.01)。給予化合物DXL-A-22(2 mg·kg-1，i.g.)7 d可明顯降低TNF-α、c-Fos mRNA表達(P<0.01)，在DRG的抑制率分別為39%和32%，在脊髓的抑制率分別為47%和72%，與假手術組比較差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 4 Effect of DXL-A-22 on expression of pCaMKⅡα and pCREB in DRG

Fig 5 Effect of DXL-A-22 on expression of pJAK2 and pSTAT3 in DRG

Fig 6 Effect of DXL-A-22 on expression of TNF-α and c-fos mRNA in DRG and spinal cord

2.3 急性毒性小鼠灌胃給予化合物DXL-A-22(1 000 mg·kg-1，相當于小鼠劑量的1 000倍)后，72 h內，其行為和自主活動正常，觀察的14 d內沒有任何死亡或其他致命性損傷現(xiàn)象。

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是臨床上最常見的慢性疼痛，由疾病或軀體感覺系統(tǒng)的損傷引起。神經(jīng)病理性疼痛的治療是醫(yī)學上公認的難題。治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物主要包括抗驚厥藥(加巴噴丁、普瑞巴林)、抗抑郁藥(阿米替林)、阿片類鎮(zhèn)痛藥(嗎啡)、NMDA受體拮抗劑(氯胺酮)及非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥物(氟比洛芬酯)等，這些藥物治療效果并不明顯，臨床上僅有不超過一半的病人得到有意義的緩解，且長期服用這些藥物會引起一系列的不良反應，如骨髓抑制、內分泌改變、心臟毒性、呼吸抑制、成癮性、耐藥性等[8]。因此，有效治療神經(jīng)病理性疼痛且無明顯毒副作用的藥物有待進一步研發(fā)。

前期研究顯示，螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物有明顯的鎮(zhèn)痛和抗炎作用，對動物的自主活動、體溫、心率等無明顯影響[3]。DXL-A-22為螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物，本研究采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型，評價其抗神經(jīng)病理性疼痛作用。實驗結果顯示，化合物DXL-A-22可抑制坐骨神經(jīng)損傷引發(fā)的機械刺激過敏和熱刺激痛覺過敏，表明DXL-A-22有明顯的抗神經(jīng)病理性疼痛作用。DXL-A-22對CCI大鼠的機械刺激痛閾提高率和熱刺激最大鎮(zhèn)痛百分率與陽性對照加巴噴丁相當，而劑量小50倍，安全性提高。

CaMKⅡ為絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α、β、γ、δ四種基因編碼，分布于外周和中樞神經(jīng)元。CaMKⅡα主要分布于疼痛產(chǎn)生區(qū)背根神經(jīng)節(jié)和脊髓。當受到傷害性刺激時，Ca2+流增加，CaMKⅡα通過與增加的Ca2+結合而在Thr286位點自動磷酸化。磷酸化的CaMKⅡα促使CREB在Ser133位點自動磷酸化，從而活化CREB。p-CREB與啟動子結合，使TNF-α、c-Fos表達增加，從而引發(fā)疼痛反應[9]。CaMKⅡα/CREB信號通路在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)損傷后脊髓中p-CaMKⅡα與p-CREB表達明顯增加，阻斷p-CaMKⅡα能抑制p-CREB表達，明顯減輕小鼠痛覺過敏[10]。JAK2是酪氨酸激酶，當受到特定刺激時，JAK2被活化，磷酸化后的JAK2活化轉錄因子STAT3，STAT3磷酸化后進入細胞核，引發(fā)轉錄反應，促使炎癥細胞因子TNF-α的產(chǎn)生[11]。c-Fos為STAT3的靶基因，STAT3通過磷酸化活化后,引起靶基因c-Fos的激活和表達[12]。JAK2/STAT3信號通路與神經(jīng)痛相關，神經(jīng)損傷后，脊髓p-JAK2和p-STAT3表達增加，引起神經(jīng)炎癥反應[13]。本研究結果顯示，化合物DXL-A-22明顯抑制CCI大鼠DRG中p-CaMKⅡα、p-CREB、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達，提示DXL-A-22的抗神經(jīng)病理性疼痛作用與抑制CaMKⅡα/CREB和JAK2/STAT3信號通路相關。

在外周神經(jīng)傷害中，前炎癥細胞因子TNF-α是早期退行性變化的主要調節(jié)者，在神經(jīng)病理性疼痛中扮演重要角色。神經(jīng)傷害可使DRG和脊髓中TNF-α表達增加，抑制TNF-α可以減輕神經(jīng)傷害引起的機械刺激[14]。c-Fos，即刻早期基因，常作為激活疼痛神經(jīng)元的標志。當機體接受外界刺激時，c-Fos被快速誘導轉錄，翻譯出的Fos迅速進入核內，組成二聚體，與蛋白激活子結合，刺激轉錄。抑制神經(jīng)系統(tǒng)c-Fos表達，可減輕神經(jīng)病理性痛大鼠的疼痛行為[15]。本研究結果顯示，化合物DXL-A-22明顯抑制CCI大鼠DRG和脊髓TNF-α、c-Fos mRNA的表達，表明DXL-A-22通過抑制TNF-α、c-Fos mRNA表達，緩解神經(jīng)病理性疼痛。

本文首次研究螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物DXL-A-22的抗神經(jīng)病理性疼痛作用，探討其抗神經(jīng)病理性疼痛的機制與抑制背根神經(jīng)節(jié)CaMKⅡα/CREB、JAK2/STAT3信號通路，降低背根神經(jīng)節(jié)及脊髓中TNF-α和c-Fos表達相關。該研究為螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物的結構改造和研發(fā)高效低毒的抗神經(jīng)病理性疼痛藥物提供實驗依據(jù)。

(致謝：本實驗在北京大學藥學院分子與細胞藥理學實驗室和天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室完成，對所有提供技術平臺和技術協(xié)作的老師同學表示感謝。)