丁紅映 王明 謝潔

摘要：低溫是植物生長(zhǎng)過(guò)程中面臨的主要非生物脅迫之一，植物的生長(zhǎng)發(fā)育與生理代謝直接受到低溫的影響。低溫脅迫下，植物從內(nèi)源激素、膜質(zhì)組成、抗氧化成分及基因轉(zhuǎn)錄水平等多個(gè)方面做出復(fù)雜而劇烈的響應(yīng)，因此，植物抗寒性研究是農(nóng)業(yè)和植物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。本文從植物形態(tài)特征、生理生化變化、分子水平響應(yīng)等方面系統(tǒng)論述植物低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制;比較了直接、間接和綜合評(píng)價(jià)植物耐低溫性的研究方法;分析了植物抗凍鍛煉、外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控、基因工程等途徑提升植物耐低溫性的效果，并對(duì)以后的研究方向進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：低溫脅迫;響應(yīng)機(jī)制;研究方法;耐低溫性

中圖分類號(hào)：Q945.78;S184 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0031-05

霜凍、寒潮及低溫冷害是出現(xiàn)于早秋和晚春時(shí)節(jié)的主要農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害。在全球氣溫變暖的大環(huán)境下，由于低溫災(zāi)害頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響到我國(guó)農(nóng)林業(yè)的發(fā)展（2018年4月份中國(guó)西北、華北等地遭受嚴(yán)重低溫凍害，其中甘肅省蔬菜、果樹(shù)、花椒等農(nóng)作物受災(zāi)33.583萬(wàn)hm2，絕收10.174萬(wàn)hm2）。關(guān)于植物低溫脅迫機(jī)制的研究主要從外觀形態(tài)和生理生化變化以及分子應(yīng)答等方面展開(kāi)，隨著研究的深入，重點(diǎn)趨向于低溫響應(yīng)關(guān)鍵基因的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究，其中轉(zhuǎn)錄因子和miRNA 成為研究熱點(diǎn)。由于低溫脅迫類型復(fù)雜，植物對(duì)低溫的適應(yīng)性受多基因調(diào)控，不同作物低溫評(píng)價(jià)指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一，在植物抗寒評(píng)價(jià)方法方面進(jìn)展緩慢，制約了植物耐寒資源的鑒定和機(jī)制研究工作的深入開(kāi)展。本文主要從植物低溫脅迫響應(yīng)的機(jī)制、植物耐低溫性研究方法和提高植物耐低溫性途徑等方面展開(kāi)綜述，旨在為植物抗寒性研究提供理論參考。

1 植物低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制

1.1 植物低溫脅迫下的形態(tài)特征

在低溫脅迫下，形態(tài)特征變化是植物受到脅迫最直觀的體現(xiàn)，輕而長(zhǎng)期低溫會(huì)使植株生長(zhǎng)遲緩、苗弱、萎蔫、黃化、坐果率低、產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降[1-2];重而短時(shí)低溫下植株葉片明顯褐變，葉片葉柄軟化，透明，呈水漬狀，出現(xiàn)脫水現(xiàn)象，組織柔軟并萎蔫皺縮，凍害斑點(diǎn)明顯[3]。研究發(fā)現(xiàn)，植物的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與抗寒性具有密切相關(guān)性，包括植物的葉片厚度、氣孔密度、鱗芽有無(wú)、根冠比大小、花器官大小以及厚度、柵欄組織/海綿組織大小等[4]。抗寒性較強(qiáng)的植物的葉片氣孔密度較小，角質(zhì)層和上下表皮比較厚，葉肉細(xì)胞排列緊密，葉片組織結(jié)構(gòu)也比較緊密，根冠比較大[5]，細(xì)胞間空隙小，枝條木質(zhì)部、韌皮部和髓的褐變程度較小[6]，有的具有冬芽結(jié)構(gòu)[7]。

楊寧寧等對(duì)北方油菜抗寒性研究結(jié)果表明，抗寒性強(qiáng)的冬油菜苗期表現(xiàn)匍匐生長(zhǎng)，柵海比小，氣孔面積小，地下部干質(zhì)量大[5]。田雪飛研究發(fā)現(xiàn)，植物遭受一定低溫后引起了葉片葉緣失綠，根系受損甚至枯死，開(kāi)花結(jié)實(shí)率下降，果實(shí)畸形，甚至植株死亡[8]。許瑛等對(duì)菊花葉片解剖結(jié)構(gòu)緊密度指標(biāo)的分析表明，抗寒性強(qiáng)的菊花品種葉片和上表皮較厚，柵欄組織發(fā)達(dá)，葉肉細(xì)胞排列緊密，胞間空隙小，抗寒性差的品種則表現(xiàn)為葉片上表皮較薄，柵欄組織層數(shù)少、厚度薄，葉肉細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間隙大[9]。何煜明等研究表明，在水稻幼苗期進(jìn)行低溫脅迫，因其葉片受到低溫冷害，會(huì)使其半飽和光強(qiáng)降低，對(duì)光能利用率產(chǎn)生影響，同時(shí)，水稻葉片對(duì)于光強(qiáng)的耐受程度也大幅下降[10]。姚利曉等在研究中表明，低溫條件下，轉(zhuǎn)基因甜橙的葉片傷害率隨溫度梯度在一定范圍內(nèi)呈“S”形變化[11]。曹紅星等解剖低溫處理下椰樹(shù)葉片的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的下降，細(xì)胞間隙越大，海綿組織和柵欄組織結(jié)構(gòu)愈發(fā)不規(guī)則[12]。

1.2 植物在低溫脅迫下的生理生化變化

植物在低溫脅迫下的生理生化變化主要體現(xiàn)在：葉綠素合成受阻，各種光合酶活性受到抑制，故而使光合速率下降[13];光合作用減弱;呼吸代謝失調(diào)[14];細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，體內(nèi)的各種代謝發(fā)生紊亂;植物體內(nèi)的滲透物質(zhì)和水含量也會(huì)有改變。

低溫條件下，植物的呼吸作用在冷害初期短時(shí)加強(qiáng)后隨溫度的下降而下降[15]。孫雙印對(duì)低溫（25 ℃為對(duì)照、10、5、0 ℃ 為處理，處理時(shí)間為1 d）脅迫下白玉蘭與紫葉李光合生理特征研究顯示，溫度通過(guò)影響核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）活性限制和RuBP再生速率來(lái)控制葉綠體的光合速率，與正常溫度相比，低溫處理下的羧化效率總體較低[16]。我們發(fā)現(xiàn)馬鈴薯在同等光合有效輻射下，凈光合速率隨環(huán)境溫度的下降而降低，不同基因型馬鈴薯對(duì)10 ℃溫度的適應(yīng)性有差異，10 ℃條件下的馬鈴薯凈光合速率與基因型耐寒性呈正相關(guān)[17]。低溫逆境下植物細(xì)胞出現(xiàn)收縮，細(xì)胞膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，膜脂從液晶態(tài)變成凝膠態(tài)，細(xì)胞膜一旦受損，離子發(fā)生外滲，細(xì)胞導(dǎo)電性就會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化。植物在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），活性氧參與細(xì)胞內(nèi)的生理生化反應(yīng)，在植物正常生長(zhǎng)的情況下，ROS分子能夠被氧化防御機(jī)制清除，即植物的保護(hù)性應(yīng)急反應(yīng)[18-19]。但是，在低溫、干旱或者鹽等逆境脅迫環(huán)境中，活性氧的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被打破，且ROS含量急劇増加，從而對(duì)植物造成傷害，產(chǎn)生傷害的可能原因是低溫脅迫超出了植物承受的極限，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[20]。劉貝貝等研究表明，在低溫脅迫下，不同石榴品種的SOD活性呈一直上升趨勢(shì)或者先上升后下降趨勢(shì)，并且不同品種增加的幅度不同，到達(dá)峰值的溫度也不同[21]。

植物組織中自由水含量、結(jié)合水含量、總含水量以及自由水與結(jié)合水含量的比值可以作為評(píng)價(jià)植物抗寒性的指標(biāo)[22]。吳飛等研究顯示，隨著處理溫度的下降，總含水量逐漸降低。在一定的范圍內(nèi)，隨處理溫度的降低，自由水/束縛水比值逐漸下降;超過(guò)一定的范圍，雖然自由水和束縛水含量緩慢下降，但比值幾乎不再有變化。自由水/束縛水比值較低，說(shuō)明細(xì)胞液濃度高，保水能力強(qiáng)，抗寒能力較強(qiáng)[23]。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化與植物的低溫脅迫也有聯(lián)系，可溶性蛋白和脯氨酸的研究較多?？扇苄缘鞍资且环N能夠提高植物保水能力和降低細(xì)胞組織間結(jié)冰可能性的親水性較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。王卓敏等研究發(fā)現(xiàn)，抗寒性較強(qiáng)品種的可溶性蛋白含量隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升的趨勢(shì)，但是不同品種間存在差異，有些品種則先上升后趨于平緩，還有一些品種可溶性蛋白含量變動(dòng)不顯著[24]。脯氨酸是一種親水性有機(jī)溶劑，與細(xì)胞水勢(shì)呈負(fù)相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯植株脯氨酸含量與抗寒性之間具有高度相關(guān)性，抗寒性越強(qiáng)的植株脯氨酸含量越高[25]。

1.3 植物低溫脅迫下的分子響應(yīng)

目前，低溫信號(hào)途徑研究得比較清楚的是CBF[C-repeat（CRT）-binding factors]依賴的信號(hào)途徑，該途徑屬ABA非依賴性，在CBF途徑中，CBF1、CBF2和CBF3是目前研究熱點(diǎn)，CBF1與CBF2和CBF3同屬一小蛋白家族，且發(fā)現(xiàn)CBF2對(duì)CBF1、CBF3負(fù)調(diào)控，即CBF2能夠阻遏調(diào)節(jié)CBF1、CBF3的表達(dá)[26]。CBF基因受到低溫、光照、周期節(jié)律等的調(diào)控，因此，CBF信號(hào)途徑是低溫信號(hào)與其他信號(hào)相互作用的重要橋梁。研究顯示，植物體內(nèi)含有鈣離子信號(hào)途徑和ICE1（inducerof CBF expression 1）-CBF-寒冷響應(yīng)途徑調(diào)節(jié)CBF基因的表達(dá)[27]。質(zhì)膜感受到冷信號(hào)，胞質(zhì)中的三磷酸肌醇（IP3）含量發(fā)生變化，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的積累，并與鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（CAMTA3）形成復(fù)合物，CAMTA3與CBF2啟動(dòng)子上CG-1元件結(jié)合，激活CBF的表達(dá)。ICE1是類似MYC的 b HLH轉(zhuǎn)錄因子，可特異地結(jié)合到CBF3啟動(dòng)子的MYC作用元件，激活CBF3的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物CBF結(jié)合到多種寒冷和脫水應(yīng)答基因，包括它們啟動(dòng)子的CCGAC核心基序上，進(jìn)而誘導(dǎo)這些功能基因表達(dá)，最終使植物獲得低溫耐受能力[28]。

構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及鑒定參與網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)闡明植物逆境應(yīng)答機(jī)制和挖掘抗逆分子改良有著重要的意義。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在抵御逆境反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其數(shù)量眾多，廣泛分布于陸生植物中[29]。NAC蛋白的N端含有較為保守的DNA結(jié)合域，C端有的是序列高度可變的與轉(zhuǎn)錄激活活性調(diào)控多樣性有關(guān)的TRR區(qū)域，有的是負(fù)責(zé)與質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜錨定的α螺旋跨膜基序（TM）[30]。邊境等利用Illumina Hi Seq技術(shù)，分別構(gòu)建了5 ℃和22 ℃處理下的2個(gè)玉米葉組織轉(zhuǎn)錄組。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共分離出30條上調(diào)和8條下調(diào)的低溫響應(yīng)NAC基因，這些NAC被分為12個(gè)亞族（NAC a-1），其中7條上調(diào)低溫響應(yīng)NACs屬于逆境相關(guān)亞家族（Stress related/NAC-h）[31]。黃榮峰等研究表明，低溫鍛煉是提高植物對(duì)低溫的抗性并誘導(dǎo)產(chǎn)生冷反應(yīng)基因的途徑之一。擬南芥的COR（cold-regulated）基因是冷反應(yīng)基因之一，冷反應(yīng)基因編碼的多肽產(chǎn)物均具有親水特性、簡(jiǎn)單的氨基酸組成和重復(fù)的氨基酸序列，且在水相緩沖液中呈可溶狀[32]。Catalá等研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 基因的表達(dá)會(huì)使植物對(duì)各種逆境環(huán)境產(chǎn)生反應(yīng)，罕見(jiàn)的冷誘導(dǎo)1A（RCI1A）基因編碼14-3-3 psi異構(gòu)體，并通過(guò)控制冷誘導(dǎo)的基因表達(dá)對(duì)擬南芥的耐寒和冷馴化起負(fù)調(diào)控的作用[33]。Satoshi Kidokoro等研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄ACTIVATOR3（CAMTA3）和CAMTA5會(huì)對(duì)迅速降低溫度和誘導(dǎo)DREB1s的表達(dá)做出反應(yīng)，但是這些蛋白質(zhì)對(duì)溫度逐漸降低不會(huì)做出反應(yīng)[34]。

miRNAs通過(guò)對(duì)靶基因 mRNA進(jìn)行切割或翻譯抑制調(diào)節(jié) mRNA 的表達(dá)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)中起到重要的作用[35]。安鳳霞等在抗寒品種中檢測(cè)到34個(gè)上調(diào)表達(dá)，43個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNA，在低溫敏感品種檢測(cè)到50個(gè)上調(diào)表達(dá)，45個(gè)下調(diào)表達(dá)miRNA，這些保守或非保守miRNA在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及抵御低溫逆境過(guò)程中起作用[36]，筆者所在課題組研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)冷馴化的馬鈴薯中其miR390通過(guò)負(fù)調(diào)控富含亮氨酸重復(fù)序列型類受體蛋白激酶基因（LRR-RLK）對(duì)低溫產(chǎn)生響應(yīng)（待發(fā)表）。肖仕等的研究揭示了冷害脅迫下擬南芥二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶DGAT1和二酰甘油激酶DGK2、DGK3和DGK5調(diào)控二酰甘油（DAG）、三酰甘油（TAG）和磷脂酸（PA）的動(dòng)態(tài)平衡，維持膜系統(tǒng)的完整性及細(xì)胞內(nèi)氧還狀態(tài)，從而影響植物對(duì)冷害的抗性反應(yīng)。植物遭受低溫逆境時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝活動(dòng)十分活躍，擬南芥細(xì)胞內(nèi)的DAG、TAG和PA各組分的含量在低溫脅迫下均顯著升高。

植物在冷脅迫下，直接參與抗逆性反應(yīng)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物主要分為調(diào)控蛋白和功能蛋白。常見(jiàn)的調(diào)控蛋白包括鈣調(diào)蛋白（calmodulins，CaMs）、鈣依賴性蛋白激酶（CaM domain-containing protein kinases，CDPKs）、類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白（calcineurin B-like proteins，CBLs）、促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）和互作蛋白激酶（CBL-interacting protein kinases，CIPKs）等;常見(jiàn)的功能蛋白包括胚胎后期豐富蛋白（LEA）、熱休克蛋白（HSPs）、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的生物合成所需的酶、防凍劑和解毒蛋白質(zhì)。

2 植物耐低溫性研究常見(jiàn)的方法

2.1 直接鑒定法

植物耐低溫性大田直接鑒定法是應(yīng)用最廣泛的一種鑒定方法，包括田間自然鑒定法、生長(zhǎng)恢復(fù)法、人工模擬氣候室法等[4]。

田間鑒定法是根據(jù)季節(jié)溫度的變化規(guī)律，按一定的標(biāo)準(zhǔn)比較植物的器官、組織的受凍情況，根據(jù)植物葉片的顏色、水漬斑以及莖桿的透明度來(lái)評(píng)價(jià)植物的抗凍性。植物受凍害程度越低，說(shuō)明抗寒性越強(qiáng)，抗寒性強(qiáng)的品種，評(píng)分也就越低。田間鑒定法大多采用聚類分析法來(lái)分析，聚類分析法是將樣品按相似程度劃分類別，使得同一類中元素之間的相似性比其他類元素相似性更強(qiáng)的一種理想的多變量統(tǒng)計(jì)技術(shù)。劉艷等通過(guò)系統(tǒng)聚類和相關(guān)性系數(shù)法來(lái)探討各植物間的親緣關(guān)系。得出聚類分析法在植物物種分類及鑒別中是一種可行性手段，其結(jié)果與相關(guān)性分析結(jié)果相吻合[37]。魏亮等的研究結(jié)果顯示，馬鈴薯材料損傷評(píng)分為2，損傷較輕，抗寒性較好;損傷評(píng)分為6，植株基本死亡，抗寒性最差[38]。田間自然霜凍法的分級(jí)細(xì)致合理，適合大批量的實(shí)驗(yàn)材料，但是同時(shí)，該方法周期性長(zhǎng)，重復(fù)性差，受季節(jié)的限制。生長(zhǎng)恢復(fù)法是將植物材料放在不同的溫度梯度下進(jìn)行處理，取出后放在適宜生長(zhǎng)的條件下測(cè)定恢復(fù)生長(zhǎng)的最低溫度，確定它們抗寒性的一種比較可靠并普遍應(yīng)用的方法[4]。田娟等利用電導(dǎo)率對(duì)植物抗寒性進(jìn)行比較，得出隨著脅迫程度的加深和脅迫時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)，植物均呈現(xiàn)出膜相對(duì)透性逐漸增大的趨勢(shì)，但不同品種間的增幅卻各不相同[39]。人工模擬氣候室法是一種周期較短、可重復(fù)性高、不受季節(jié)限制的方法，但是模擬人工氣候室的成本較高，并且人工氣候室的空間條件有限，難以進(jìn)行大批量的材料處理。

2.2 間接鑒定法

植物耐低溫性間接鑒定法包含很多的鑒定指標(biāo)，主要有細(xì)胞膜電解質(zhì)的測(cè)定、氧化還原酶系統(tǒng)、可溶性糖含量的測(cè)定、脯氨酸的測(cè)定、葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)定以及DAB組織定位等。

細(xì)胞膜系統(tǒng)通常是最先受到低溫傷害的部位，逆境導(dǎo)致細(xì)胞膜透性加大，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)向膜外滲透，電解質(zhì)滲透增大。測(cè)定電解質(zhì)滲漏一直被用作衡量細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)在逆境中穩(wěn)定性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，通過(guò)定義電解質(zhì)透出率達(dá)50%時(shí)的溫度為半致死溫度[40]。進(jìn)一步優(yōu)化利用logistic曲線描述低溫對(duì)植物細(xì)胞膜的傷害過(guò)程，Rajashekar等提出曲線拐點(diǎn)為L(zhǎng)T50的觀點(diǎn)[41]并在我國(guó)得到了廣泛認(rèn)同。李飛等成功地運(yùn)用該方法對(duì)馬鈴薯資源進(jìn)行了抗寒性鑒定[42-45]。相對(duì)電導(dǎo)率法技術(shù)完善，不受季節(jié)的限制應(yīng)用廣泛，不足之處是該方法比較繁瑣、周期長(zhǎng)、重復(fù)性不好，不適合大批量的材料的篩選。

林艷等探究了不同大葉女貞品種的抗寒性，隨著幼苗葉片處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其丙二醛和可溶性糖含量逐漸上升[46]。劉貝貝等對(duì)6種石榴品種低溫處理，發(fā)現(xiàn)抗寒性較強(qiáng)的材料脯氨酸含量先上升后下降，抗寒性較弱的品種隨著冷脅迫的處理脯氨酸含量不斷上升[21]。丁旭等研究發(fā)現(xiàn)，隨冷凍脅迫加強(qiáng)，馬鈴薯葉片斑塊越多，說(shuō)明抗凍能力越差[47]。DAB組織定位操作比較簡(jiǎn)單，成本較小，結(jié)果明顯，比較容易辨別，重復(fù)性強(qiáng)，但是容易受到人為操作的影響。

2.3 綜合鑒定法

植物抗寒性機(jī)理十分復(fù)雜，采用單一的指標(biāo)難以反映其抗寒性本質(zhì)[48-49]，因此在探究植物的耐低溫性研究時(shí)，采用多個(gè)生理生化指標(biāo)去衡量的綜合鑒定法，可增強(qiáng)準(zhǔn)確性，常運(yùn)用到的分析方法有主成分分析法，隸屬函數(shù)法和聚類分析法等。主成分分析法是將多個(gè)具有一定相關(guān)性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)計(jì)算轉(zhuǎn)化成個(gè)數(shù)較少且代表性彼此獨(dú)立的抗逆性綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，以減少各指標(biāo)間原有的相關(guān)性，提高評(píng)價(jià)指標(biāo)的可靠性。隸屬函數(shù)法是采用模糊數(shù)學(xué)的方法對(duì)植物抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)作為一種更為有效的方法，引用楊金紅的隸屬度計(jì)算公式[50]：

正效應(yīng)指標(biāo)：Uij=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）;

負(fù)效應(yīng)指標(biāo)：Uij=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）。

式中：Uij表示i品種j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值;Xij表示i品種j指標(biāo)的測(cè)定值;Xjmin表示所有品種j指標(biāo)的最小值;Xjmax表示所有品種j指標(biāo)的最大值;目前隸屬函數(shù)法已廣泛應(yīng)用于牧草[51]、楊樹(shù)[52]、蘋果[53]、小麥[54]、馬鈴薯[55]、胡枝子[56]、花生[57]、核桃[58]、葡萄[59]和火龍果[60]等。

楊慧菊等利用主成分分析法比較了不同馬鈴薯品種在低溫脅迫下的抗寒性[49]。許泳清等測(cè)定了馬鈴薯試管苗的細(xì)胞質(zhì)膜透性、可溶性蛋白和脯氨酸含量及丙二酸含量，并以4項(xiàng)指標(biāo)的平均隸屬度綜合評(píng)價(jià)了不同品種在低溫脅迫下的抗寒性[61]。

3 提高植物耐低溫性的途徑

3.1 植物抗凍鍛煉

將植物在非傷害性的零上低溫條件下誘導(dǎo)其抗寒力逐漸增強(qiáng)的過(guò)程稱之為抗寒鍛煉，這個(gè)過(guò)程可以在人為設(shè)置的控制低溫下進(jìn)行，也可以在自然越冬條件下進(jìn)行[62]。植物抗凍性是一個(gè)非常復(fù)雜的性狀，包括抵抗低溫對(duì)植物功能的直接影響和因冰晶形成造成的間接影響的能力。經(jīng)過(guò)抗凍鍛煉的植物有一定水平的抗凍性，而未經(jīng)過(guò)抗凍鍛煉的植物在嚴(yán)重低溫脅迫下將會(huì)死亡，抗凍鍛煉程度與植物生長(zhǎng)階段以及冬季的休眠期密切相關(guān)，不同品種的植物抗凍性有區(qū)別[3]。逆境條件下，植物內(nèi)源ABA含量也上升，葉片含水量下降，束縛水比例上升，氣孔阻力及可溶性糖含量增加，植株體內(nèi)的一些酶活性（POD、SOD、CAT、ATP酶）升高，特別是POD酶的活性有了極顯著的提高[63]。

Kazuoka等發(fā)現(xiàn)，多種植物在低溫鍛煉期間，可溶性蛋白含量隨低溫鍛煉過(guò)程抗寒性的提高而增加[64]。但是Uemura等得出不同的結(jié)論，即可溶性蛋白質(zhì)含量在低溫鍛煉中并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的改變[65]。林善枝等發(fā)現(xiàn)，在不同低溫鍛煉期間，毛白楊幼苗總可溶性蛋白質(zhì)含量增加，抗凍性增強(qiáng)，可溶性蛋白質(zhì)含量的增加有助于加強(qiáng)細(xì)胞的保水力，提高細(xì)胞內(nèi)的束縛水，降低冰點(diǎn)。用環(huán)己亞胺處理幼苗，可溶性蛋白含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，植物的抗寒性變?nèi)酰@種低溫處理的結(jié)果與逐漸縮短光照天數(shù)的結(jié)果是一致的[66]。林善枝的研究結(jié)果與劉鴻等[67]、簡(jiǎn)令成等[68]的研究一致，在低溫和短日照這2種特定條件下，植物這種潛在的抗凍基因才會(huì)表達(dá)，從而提高植物的抗凍力。筆者所在課題給研究發(fā)現(xiàn)10 ℃冷馴化10 d引起被馴化馬鈴薯材料378個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá);692個(gè)基因顯著下調(diào)，97個(gè)miRNA顯著上調(diào)表達(dá);21個(gè)miRNA顯著下調(diào)（待發(fā)表）。

3.2 外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)控作用

植物外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是一種植物激素，在低濃度下對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起促進(jìn)或者抑制的作用[69]。外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物耐低溫性影響研究常在脫落酸（ABA）、多效唑（PP333）、油菜素內(nèi)脂（BR）等中展開(kāi)。外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的主要功能是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)不良生長(zhǎng)環(huán)境的抗性。在寒冷脅迫下，脫落酸啟動(dòng)細(xì)胞抗冷基因的表達(dá)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗寒能力[70]。在水稻[71]、番茄[72]、辣椒[73]等植物上都已經(jīng)證實(shí)，抗寒性強(qiáng)的植物品種，其內(nèi)源脫落酸含量高于抗寒性弱的品種，并且發(fā)現(xiàn)脫落酸可以減輕黃瓜、南瓜、水稻、柑橘的低溫傷害[63]。

在未來(lái)的農(nóng)業(yè)和生產(chǎn)當(dāng)中，作物化控技術(shù)作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的新技術(shù)，是傳統(tǒng)農(nóng)藝技術(shù)的發(fā)展與補(bǔ)充，也是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)技術(shù)的重要配套技術(shù)[70]。當(dāng)前階段，關(guān)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用是比較狹窄的，需要開(kāi)發(fā)新的產(chǎn)品來(lái)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)匹配，在今后的開(kāi)發(fā)和創(chuàng)新過(guò)程中，品種種類多樣、高效，以及多功能的混合制劑是主要方向。

3.3 基因工程

基因工程一種是現(xiàn)代生物分子育種的技術(shù)手段?；蚴蔷幋a遺傳信息的基本遺傳單位，基因工程育種具有高效、定向和不受植物世代影響等優(yōu)點(diǎn)?；蚬こ逃N與常規(guī)育種以及分子標(biāo)記結(jié)合起來(lái)，加快了植物的育種進(jìn)程。但由于植物基因工程是一個(gè)新興研究領(lǐng)域，研究基礎(chǔ)比較薄弱，還有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究：（1）轉(zhuǎn)移多個(gè)基因的技術(shù)不成熟。植物的抗寒性是由多個(gè)復(fù)雜基因控制的，但抗寒基因工程大多是圍繞單個(gè)基因研究。（2）可利用的目的基因不多。植物的抗寒性受一個(gè)龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，涉及大量的基因，而目前分離的主要是一些保護(hù)類的基因，且多來(lái)自擬南芥等模式植物。要想植物的抗寒育種取得更大的突破，必須從不同的植物分離更多的基因，深入研究植物的抗寒分子機(jī)理。（3）轉(zhuǎn)基因的表達(dá)系統(tǒng)不完善。目前，抗寒基因工程多采用CaMV的35S組成型強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)外源基因在植物體內(nèi)的組成型表達(dá)，雖在逆境下能較好地提高植物抗寒水平，但在非逆境下，這種不必要的高表達(dá)也給植物帶來(lái)許多負(fù)面效應(yīng)[74]。利用基因工程的手段，將DREB轉(zhuǎn)錄因子和抗凍蛋白基因?qū)霟煵?、水稻、油菜等植物中，相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)和方法的不斷發(fā)展，用基因工程方法提高農(nóng)作物的抗寒性必將會(huì)取得可喜的進(jìn)展，具有廣泛的實(shí)際應(yīng)用前景[75]。

4 結(jié)束語(yǔ)

植物對(duì)低溫的適應(yīng)性受多基因調(diào)控，會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，采用綜合鑒定法，能比較準(zhǔn)確地鑒定植物的抗寒性。在眾多的抗寒性指標(biāo)中，相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定應(yīng)用最為廣泛，過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等研究的也頗多，在分析的過(guò)程中一般采用主成分分析法、隸屬函數(shù)法和聚類分析法。

綜合近幾年的研究結(jié)果可以看出，植物低溫響應(yīng)機(jī)制研究重點(diǎn)已經(jīng)從基本功能基因轉(zhuǎn)向信號(hào)調(diào)控網(wǎng)路。轉(zhuǎn)錄因子處在低溫信號(hào)響應(yīng)的上游，在轉(zhuǎn)錄水平上主導(dǎo)著低溫相關(guān)蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制正被逐步闡明。另外，miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在低溫響應(yīng)中的作用機(jī)制也被逐步揭開(kāi)面紗，隨著對(duì)于miRNA作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技術(shù)手段對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中miRNA和靶基因之間的關(guān)系進(jìn)行研究，將會(huì)使人們對(duì)于植物低溫響應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解提高到一個(gè)新的水平。

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