張 昊,凌映茹,吉文亮,劉華良,朱 峰

(江蘇省疾病預(yù)防控制中心,江蘇南京 210009)

雙酚A(bisphenol A,BPA)是一類典型的環(huán)境激素,在聚碳酸酯塑料行業(yè)以及環(huán)氧樹脂行業(yè)中應(yīng)用廣泛,BPA可以與多種生理受體(如雌激素受體α/β、雌激素相關(guān)受體γ等)相互作用干擾生物體體內(nèi)激素水平,損害女性子宮、卵巢功能，降低男性精子質(zhì)量、影響嬰幼兒和青春期前期兒童的神經(jīng)發(fā)育、誘發(fā)青春期性早熟、引發(fā)肥胖等[1-2]。2011年我國衛(wèi)生部等六部門禁止BPA用于嬰幼兒奶瓶的生產(chǎn)。雙酚S(bisphenol S,BPS)作為BPA的替代物,具有類似于BPA的結(jié)構(gòu)和更強(qiáng)的酸性、穩(wěn)定性。雖然有毒理學(xué)研究表明,低劑量BPS可以影響魚類[3]和嚙齒類動物[4]的內(nèi)分泌系統(tǒng)、影響雌激素分泌、降低繁殖能力、導(dǎo)致肥胖等[2,5],但缺少足夠的生理學(xué)毒理學(xué)證據(jù),目前世界上并沒有相關(guān)的使用禁令。由于BPA和BPS在食品包裝材料等行業(yè)的廣泛應(yīng)用,在多種食品樣品中存在BPA和BPS檢出,尤其是在豬肉、雞蛋、海鮮、水果等食品樣品中[6]。

雞蛋粉是指鮮蛋經(jīng)過打蛋、分離、過濾、均質(zhì)、巴氏殺菌、噴霧干燥而制成的干蛋產(chǎn)品,是蛋類制品的一種。雞蛋粉主要有全蛋粉、蛋黃粉、蛋白粉三種,其中全蛋粉由于其營養(yǎng)價值與鮮雞蛋接近,在使用、運輸、儲存方面比鮮雞蛋更為便捷,因此被廣泛使用于蛋糕、餅干、調(diào)味料、油炸食品等掛糊產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中。由于全蛋粉的原料——雞蛋中可能存在BPA和BPS,同時在全蛋粉的生產(chǎn)、包裝過程可能存在的污染,均會使BPA和BPS在全蛋粉中進(jìn)一步積累,使得這兩類物質(zhì)進(jìn)入以全蛋粉為原材料的下游相關(guān)食品中,造成人體對BPA和BPS的暴露。而目前并沒有關(guān)于全蛋粉中雙酚類化合物的測定方法,因此建立相應(yīng)的檢測方法十分有必要。

目前BPA及其類似物的檢測方法主要有液相色譜法[7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-11]和液相色譜-質(zhì)譜法[12-16],其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法由于其較高的分離效率和靈敏度而被廣泛應(yīng)用。目前對于食品中BPA和BPS的前處理方式主要集中在固相萃取法(solid phase extraction,SPE)[11-16]。王勝利等使用QuEChERS-SPE法對于嬰兒配方奶粉進(jìn)行凈化,能夠有效去除奶粉中基質(zhì)對多種雙酚化合物的干擾[13];張媛媛等使用HLB小柱完成瓶裝水中BPA和BPS的凈化富集,BPA和BPS的平均回收率均高于95%[14];張艷等使用了GCB小柱完成了對羅非魚、豬肉罐頭等食品基質(zhì)的凈化,其中BPA和BPS的平均回收率均高于85%[15];曹杰等同樣使用GCB小柱完成了谷物類樣品基質(zhì)的凈化,其中BPA和BPS的平均回收率均高于90%[16]。然而,這些工作并未涉及脂質(zhì)含量高(脂質(zhì)含量>30%)的樣品。與豬肉、雞蛋等食品相比,全蛋粉中脂肪含量≥42%[17],基質(zhì)中脂肪含量高,對于前處理過程中去除基質(zhì)、降低基質(zhì)干擾的要求更高,需要建立更為有效、便捷的前處理方法才能保證這類樣品中雙酚類物質(zhì)測定的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

分散系固相萃取-增強(qiáng)性脂質(zhì)基質(zhì)去除(dispersive solid-phase extractions enhanced matrix removal lipid,dSPE-EMR-Lipid)是一種新型脂質(zhì)凈化手段,該方法利用填料表面修飾基團(tuán)的空間結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中長碳鏈存在尺寸排阻作用以及填料與脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中長碳鏈的吸附作用,對于長鏈脂質(zhì)有極強(qiáng)的吸附去除效果[18-20]。本文使用dSPE-EMR-Lipid去除樣品中的脂質(zhì)后,使用PRiME HLB小柱進(jìn)一步凈化,建立快速、便捷地測定全蛋粉中的BPA和BPS的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全蛋粉 購買于超市和網(wǎng)店,總共20份(總共15種不同品牌,其中5種品牌為兩種不同批次);BPA(CAS:80-05-7)、BPS(CAS:80-09-1) 純度>99%,上海TCI公司;BPS-13C12純度>98.0%,加拿大TRC公司;BPA-D4純度>98.0%,美國C/D/N Isotopes公司;Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 美國Waters公司;乙腈、甲醇、甲酸、丙酮 色譜純,德國Merk公司;實驗用純水 實驗室自制一級水;純水 色譜級，美國Fisher公司;瓶裝純凈水 浙江娃哈哈公司。

SuperClean GCB/NH2雙層固相萃取柱(GCB 500 mg+NH2500 mg/6 mL)、SuperClean GCB固相萃取柱(500 mg/6 mL) 美國Supelco公司;Waters PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL) 美國Waters公司;Bond Elut LRC NH2固相萃取柱(100 mg/10 mL)、Bond Elut EMR-Lipid 美國Agilent公司;LC-30A超高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司;AB Sciex QTRAP 5500質(zhì)譜儀 美國AB Sceix公司;臺式離心機(jī) 德國Sigma公司;氮吹儀 美國Organomation公司;Vortex-6渦旋混合器 江蘇其林貝爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)溶液配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取BPA、BPS標(biāo)準(zhǔn)品 10 mg(精確至0.1 mg)至10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,配制成1000 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取適量的BPA、BPS單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液至10 mL容量瓶中,使用甲醇-水(v∶v=1∶4)稀釋配制成質(zhì)量濃度BPA 1.0 mg/L,BPS 0.4 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.1.2 同位素內(nèi)標(biāo)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取同位素內(nèi)標(biāo)BPA-D4、BPS-13C1210 mg(精確至0.1 mg)至10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,配制成1000 mg/L的單一同位素內(nèi)標(biāo)儲備液。準(zhǔn)確移取適量的BPA-D4、BPS-13C12同位素內(nèi)標(biāo)儲備液至10 mL容量瓶中,使用甲醇-水(v∶v=1∶4)稀釋配制成質(zhì)量濃度為BPA-D40.5 mg/L,BPS-13C120.1 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)使用液。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 樣品提取 稱取混勻后的樣品1.0 g置于15 mL離心管中,加入3 mL水,渦旋混勻,加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)使用液和5 mL乙腈,渦旋混勻后超聲提取30 min,9000 r/min離心10 min,上清液全部轉(zhuǎn)移至裝有1 g已活化的dSPE-Lipid-EMR的50 mL離心管中(EMR-Lipid 使用前加入5 mL水進(jìn)行活化),渦旋1 min,12000 r/min離心5 min,所得上清液用純水稀釋至25 mL,加入50 μL甲酸,充分搖勻后,12000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一個干凈的50 mL離心管,待凈化。

1.2.2.2 凈化 將所得上清液使用PRiME HLB柱(使用前依次用18 mL甲醇和6 mL水活化)上樣,棄去濾液,分別使用6 mL水、6 mL甲醇-水溶液(v∶v=1∶1)淋洗,待淋洗液完全通過柱床后用洗耳球吹干柱床中的液體,用6 mL甲醇-丙酮(v∶v=4∶1)洗脫,洗脫液用氮氣吹至近干。用1 mL甲醇-水(v∶v=1∶4)溶解殘渣,待LC-MS/MS測定。

空白實驗:使用純水代替樣品,使用與樣品相同的前處理得到實驗的過程空白值。

1.2.3 實驗用水的選擇 本實驗考察了Fisher牌色譜級純水、娃哈哈牌純凈水和實驗室自制一級純水中BPA和BPS的本底值。使用4 mL上述三種純水分別按1.2.2中空白實驗進(jìn)行富集,上機(jī)測定。選擇本底值低、成本低、易獲得的純水作為實驗用水。

1.2.4 樣品除脂凈化手段的選擇 考察了不同凈化手段對基質(zhì)的凈化效果和對加標(biāo)模擬樣品的回收效果。使用加標(biāo)水平為BPA 5 μg/kg、BPS 2 μg/kg的全蛋粉模擬樣品,比較不同除脂方式與GCB小柱協(xié)同處理(正己烷萃取后使用GCB小柱凈化、冷凍(-20 ℃,2 h),除脂后使用GCB小柱凈化、使用GCB/NH2雙層SPE小柱凈化、先使用GCB小柱凈化后洗脫液使用LRC NH2小柱凈化)和EMR-Lipid與不同SPE小柱協(xié)同處理(EMR-Lipid除脂后使用GCB小柱凈化、EMR-Lipid除脂后使用PRiME HLB小柱凈化、EMR-Lipid除脂后使用PPL小柱凈化)對于模擬樣品提取液的處理效果,根據(jù)不同手段的回收率高低和前處理過程需要的時間長短選擇合適的樣品前處理手段。

1.2.5 色譜條件 色譜柱 Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:35 ℃;樣品室溫度:4 ℃;流速:0.3 mL/min;流動相 A:甲醇;流動相B:水,具體流動相洗脫程序見表1;進(jìn)樣量:5 μL。本文考察了甲醇-0.1%甲酸水;甲醇-水;甲醇-0.1%氨水;乙腈-水;甲醇/乙腈(v∶v=4∶1)-水;甲醇/乙腈(v∶v=2∶1)-水;甲醇/乙腈(v∶v=1∶1)-水;甲醇/乙腈(v∶v=1∶2)-水;甲醇/乙腈(v∶v=1∶4)-水作為流動相時對各種物質(zhì)峰型和分離度的影響。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for mobile phase

1.2.6 質(zhì)譜條件 離子源:ESI(-);噴霧電壓4.5 kV;源溫550 ℃;氣簾氣壓:40 psi;霧化氣壓:65 psi;干燥氣壓:65 psi;多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式(MRM)進(jìn)行采集,目標(biāo)離子質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 BPA和BPS及相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters for the BPA,BPS and corresponding isotope internal standards

1.2.7 線性方程、檢出限及定量限 實驗使用混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)使用液配制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列:BPA 1、2、5、10、20、50 μg/L,BPS 0.4、0.8、2、4、8、20 μg/L,同位素內(nèi)標(biāo)濃度:BPA-D425.0 μg/L,BPS-13C125 μg/L,使用1.2.5及1.2.6中色譜條件與質(zhì)譜條件進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai/Ais為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度Ci為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)確定儀器的檢出限和定量限。

1.2.8 回收率實驗 對低本底值的全蛋粉添加三個濃度水平:5、20、40 μg/kg(BPA),2、8、16 μg/kg(BPS),使用優(yōu)化后的前處理手段平行測定六次,計算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,連續(xù)三天,每天平行測定6次,計算其日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 實際樣品檢測 本實驗對20份從超市和網(wǎng)店購買的全蛋粉進(jìn)行檢測,驗證方法的可靠性和適應(yīng)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Analyst和MultiQuantTM軟件(美國AB SCIEX公司)采集數(shù)據(jù)并積分,使用Origin 9.0(美國Origin Lab公司)作圖,使用Microsoft Excel 2010(美國微軟公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗用水的選擇

BPA和BPS在環(huán)境中分布廣泛,可通過生產(chǎn)途徑進(jìn)入相關(guān)實驗耗材中,如果實驗中使用的水的BPA和BPS本底值過高,會對測定結(jié)果造成影響。通過空白實驗比較了Fisher牌色譜級純水、實驗室自制一級水和娃哈哈牌瓶裝純凈水中BPA和BPS的含量。結(jié)果顯示,Fisher牌色譜級純水、實驗室自制一級水以及娃哈哈牌瓶裝純凈水的BPA含量分別為0.37、0.45、2.30 μg/L,BPS含量為0.07、0.08、0.11 μg/L。三種水樣在BPS的含量十分接近,但娃哈哈牌純凈水BPA含量相對較高,不適合在本實驗中使用,實驗室自制一級水與Fisher牌色譜級純水在BPA和BPS的含量上接近,考慮到成本問題,因此選擇實驗室自制一級水作為實驗用水。

2.2 樣品除脂凈化手段的選擇

參考文獻(xiàn)[15-16]中單純使用GCB小柱對模擬雞蛋粉樣品凈化后出現(xiàn)以下問題:a、復(fù)溶后樣品溶液渾濁,使用高速離心后無改善;b、使用該樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣后,出現(xiàn)前后針進(jìn)樣BPA信號響應(yīng)明顯不同的現(xiàn)象;c、連續(xù)多針進(jìn)樣后BPA和BPS的保留時間發(fā)生漂移,且信號響應(yīng)減弱。這說明單獨使用GCB小柱無法有效凈化雞蛋粉中的基質(zhì),因此本文考察了不同的脂質(zhì)去除手段和不同填料類型SPE小柱協(xié)同凈化對雞蛋粉中基質(zhì)的凈化效果。

使用不同的除脂手段與不同類型SPE小柱協(xié)同凈化的具體結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,正己烷萃取后使用GCB小柱凈化、GCB/NH2雙層小柱凈化、EMR-Lipid除脂后使用PPL小柱凈化在BPA的回收率上高于80%,但BPS的回收率低于70%,冷凍除脂后使用GCB小柱凈化在兩個化物的回收率均低于70%,GCB小柱與LRC NH2小柱協(xié)同凈化和EMR-Lipid與GCB小柱協(xié)同凈化、EMR-Lipid與PRiME HLB小柱協(xié)同凈化在兩個化物的回收率上均高于80%,但是EMR-Lipid與GCB小柱協(xié)同凈化后BPA的基質(zhì)抑制仍然比較嚴(yán)重,同位素內(nèi)標(biāo)BPA-D4的信號抑制達(dá)到50%以上,增加EMR粉末使用量也無法改善,這說明造成抑制的并非基質(zhì)中的脂質(zhì)。推斷出現(xiàn)該情況的原因可能是GCB小柱填料為片狀結(jié)構(gòu)的石墨化炭黑,帶有芳香性的正六元環(huán)結(jié)構(gòu),且呈正電性,具備反相和離子交換雙重保留機(jī)制,既能保留非極性化合物,也能保留強(qiáng)極性化合物[21]。正由于這種強(qiáng)吸附能力,導(dǎo)致被吸附在固相萃取小柱上的一部分基質(zhì)無法通過選擇性淋洗去除,最后隨洗脫液洗脫下來。PRiME HLB柱由于其填料的選擇性保留可對多種基質(zhì)通過選擇性淋洗有效去除,從而降低基質(zhì)抑制。使用GCB小柱與LRC NH2小柱協(xié)同凈化操作復(fù)雜(LRC NH2需要將GCB小柱凈化后的洗脫液,通過活化后的LRC NH2小柱才能完成除脂操作),整個凈化過程需要40～50 min,而EMR-Lipid與PRiME HLB小柱協(xié)同凈化操作簡單(EMR-Lipid只需要兩次離心便能完成除脂操作,并且該除脂操作在PRiME HLB 小柱凈化操作前),整個凈化過程耗時為25～30 min?？紤]到EMR-Lipid除脂消耗時間更短,因此將EMR-Lipid與PRiME HLB協(xié)同凈化作為本方法的前處理方式。

表3 不同除脂方法的回收率結(jié)果Table 3 Recoveries of the different removal methods of lipid

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 流動相的選擇 雙酚類化合物自身結(jié)構(gòu)中具有酚羥基,流動相的酸堿度對于雙酚類物質(zhì)的電離效果有不同的影響。首先考察了以甲醇作為有機(jī)相時,不同酸度水相(0.1%甲酸水、水、0.1%氨水)對于BPA和BPS的峰型及分離情況,以純水為水相時BPA和BPS的信號強(qiáng)度作為參考標(biāo)準(zhǔn)。使用0.1%甲酸溶液時,兩個化合物信號基本消失,可能是因為是質(zhì)子會抑制兩個化合物在離子源中的電離;使用0.1%氨水溶液時,BPA的信號增強(qiáng)了50%,然而BPS的信號響應(yīng)降為原先的50%,但考慮到BPS屬于樣品中含量較低的目標(biāo)物,需要更高的靈敏度,0.1%氨水不適合作為水相。因此只能選擇純水作為水相。

隨后考察了以純水作為水相,比較甲醇、乙腈以及甲醇/乙腈混合溶劑(v∶v=4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4)對BPA和BPS響應(yīng)信號的影響。以甲醇為有機(jī)相時,BPA和BPS的信號強(qiáng)度作為參考標(biāo)準(zhǔn)。使用乙腈時,BPA的信號響應(yīng)明顯增強(qiáng),但是在目標(biāo)信號峰附近存在干擾峰;使用甲醇/乙腈的混合溶劑(v∶v=4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4)對兩個化合物的信號響應(yīng)并沒有提高,因此選用純水和甲醇作為方法流動相。

2.3.2 色譜柱的選擇 考察了BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)對于BPA和BPS的色譜分離情況。兩類色譜柱均能給出對稱性良好的峰型,但BEH C18柱作為分析柱時峰型更為尖銳,因此選擇BEH C18柱作為分析柱。該色譜條件優(yōu)化結(jié)果與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相符[15-16],標(biāo)準(zhǔn)品中BPA、BPS及其同位素內(nèi)標(biāo)的提取離子流圖見圖1。

圖1 BPA和BPS及相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of BPA,BPS and corresponding isotope internal standards注:A:BPA 20 μg/L;B:BPA-D4 25 μg/L;C:BPS 8 μg/L;D:BPS-13C12 5 μg/L。

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

如表4所示,BPA和BPS在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)確定儀器的檢出限和定量限,可以得到BPA的檢出限為0.3 μg/kg,定量限為1.0 μg/kg,BPS的檢出限為0.1 μg/kg,定量限為0.3 μg/kg。

表4 兩種化合物的線性方程,線性范圍,相關(guān)系數(shù),檢出限,定量限Table 4 Linear equitation,linear range,correlation coefficient,LOD and LOQ of two compounds

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

表5的結(jié)果顯示,BPA在三個加標(biāo)水平的回收率為98.8%～105%,RSD日內(nèi)為3.84%～8.58%,RSD日間為5.65%～8.74%;在三個加標(biāo)水平BPS的回收率為98.5%～102.5%,RSD日內(nèi)為3.01%～7.86%,RSD日間為3.18%～7.03%。BPA和BPS的回收率均高于95%,日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%,說明本方法具有較高的回收率、精密度和穩(wěn)定性。

表5 不同加標(biāo)水平的回收率及日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 5 Recovery,intra-day relative standard deviation(n=6) and inter-day relative standard deviation(n=3)for different spiked level

2.6 樣品測定結(jié)果

使用優(yōu)化好的樣品前處理方法和儀器條件對20份購于商店或網(wǎng)店的全蛋粉進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示BPA和BPS在20份樣品中均有檢出,其中BPA含量為2.4～3.8 μg/kg;BPS含量為0.45～0.82 μg/kg。但檢出值均未超過GB9685-2016《食品接觸材料及制品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[22]中規(guī)定的特定遷移限量(SML)(BPA的SML為0.6 mg/kg,BPS為0.05 mg/kg)。

3 結(jié)論

本文針對全蛋粉中脂質(zhì)含量較高(脂質(zhì)含量>30%)的特點,使用dSPE EMR-Lipid這種對于直鏈脂質(zhì)有特異性去除的材料有效降低了因脂質(zhì)造成的基質(zhì)抑制,結(jié)合PRiME HLB小柱對于其他基質(zhì)的選擇性去除進(jìn)一步降低了基質(zhì)對于BPA和BPS測定的干擾。方法具有良好的線性(相關(guān)系數(shù)均大于0.999),目標(biāo)化合物的平均回收率均大于98%,日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%,前處理操作簡便,可以用于雞蛋粉中BPA和BPS的食品安全風(fēng)險監(jiān)測工作。