孫 盛,朱 珺,陳作國,李寶磊,陳 蘇,李言郡

(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司研究院，生物工程研究所,浙江杭州 310018)

目前,國外益生菌產(chǎn)品以食品和膳食補(bǔ)充劑兩種類型為主[1],其中,含有益生菌的膳食補(bǔ)充劑以具有功能性宣稱的片劑、粉劑和膠囊居多,部分產(chǎn)品也添加了其他功能性成分,如提取物、益生元、發(fā)酵副產(chǎn)物及其他生物活性物質(zhì)等[2]。大部分產(chǎn)品菌株標(biāo)識(shí)清晰,有明確的菌種名和活菌數(shù)量。我國益生菌相關(guān)領(lǐng)域研究起步較晚,益生菌產(chǎn)品與國外同類產(chǎn)品相比,基礎(chǔ)理論、生產(chǎn)技術(shù)與行業(yè)規(guī)范都還比較落后[1],市場上的益生菌產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊[3],產(chǎn)品標(biāo)識(shí)也較為混亂,部分產(chǎn)品缺乏明確的菌株或有效活菌數(shù)的標(biāo)識(shí)說明,多數(shù)產(chǎn)品只以出廠菌數(shù)進(jìn)行標(biāo)識(shí)。益生菌的益生功效在消費(fèi)者體內(nèi)的有效發(fā)揮必須依賴于對其充分的功能研究,有效劑量的確定以及在貨架期儲(chǔ)藏過程中活菌數(shù)的維持。產(chǎn)品中的活菌數(shù)量不穩(wěn)定,其功能就會(huì)打折扣,嚴(yán)重影響益生菌產(chǎn)品的功效發(fā)揮。因此,結(jié)合益生菌產(chǎn)品的功能特性與儲(chǔ)藏穩(wěn)定特性開展研究尤為重要。

益生菌和益生元在乳制品、飲料、奶粉、保健食品和飼料等領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用[4-5],其作為膳食補(bǔ)充劑通過選擇性地刺激腸道中定植微生物的生長和代謝,提高腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌含量,從而達(dá)到調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,改善功能性便秘的目的[6]。益生元和益生菌聯(lián)合使用兼具兩者的雙重功效且能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng),從而更好地發(fā)揮益生功能。益生元是指一種不易消化的無生命的食物成分,通過調(diào)節(jié)腸道菌群對宿主健康產(chǎn)生有益作用[7],主要有低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、水蘇糖、棉子糖等,此外多糖類物質(zhì)中的抗性淀粉、L-阿拉伯糖、菊粉、乳果糖、葡聚糖等,多元醇類中的甘露醇、木糖醇、山梨醇、乳糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇等也屬于益生元[8]。這些益生元功能相同,但因結(jié)構(gòu)、組成、特性不同,在實(shí)際應(yīng)用中需要針對食品特性和益生菌特性來選擇最合適的益生元[9]。益生元除了作為腸道微生物營養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)其生長,還能夠選擇性激活腸道中有益菌的代謝功能,使腸道菌群向有益于宿主健康的方向發(fā)展,改善腸道功能[10]。

在前期研究的過程中,我們發(fā)現(xiàn)了一株植物乳桿菌,并命名為植物乳桿菌581,它是從四川泡菜中分離得到,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良的生長特性和產(chǎn)酸特性,能在高pH和膽鹽濃度下保持較高活性,黏附性高,并具有改善便秘、潤腸通便的功效,可以應(yīng)用于發(fā)酵功能食品中。本研究以植物乳桿菌581為研究對象，通過檢測植物乳桿菌581的生長曲線和終點(diǎn)pH評價(jià)其對不同益生元的利用效率，采用小鼠便秘模型評估低聚果糖和植物乳桿菌581制成的片劑產(chǎn)品的功效，通過監(jiān)測產(chǎn)品在4、28 ℃貯存6個(gè)月的活菌數(shù)、水分含量和水分活度評價(jià)產(chǎn)品穩(wěn)定性，為其應(yīng)用于益生菌活菌片劑產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌 581 來自娃哈哈菌種保藏中心,在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)鑒定保藏;遠(yuǎn)交系昆明SPF級(jí)小鼠雄性(體重18～22 g,6～8周齡,SCXK(浙)2018-0003) 購自浙江省杭州杭斯生物科技有限公司;小鼠維持飼料 浙江省杭州杭斯生物科技有限公司;復(fù)方地芬諾酯 常州康普藥業(yè)有限公司;MRS培養(yǎng)基 英國Oxoid生物試劑有限公司;不同益生元來源如表1所示。

表1 不同益生元原料來源Table 1 Sources of different prebiotic raw materials

Baker Type B2 SterilGARD III生物安全柜 美國BAKER公司;Delta 320 pH計(jì) 瑞士METTLER TOLEDO公司;DU800型紫外分光光度計(jì) 美國Beckman公司;Eppendorf 5810 R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司;Aqualab 4TE型水分活度儀 美國Decagon AquaLab公司;HR83 Halogen水分含量測定儀 瑞士METTLER TOLEDO公司;HSZP35型高速壓片機(jī) 上海天峰制藥設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 片劑配方中益生元的篩選 配制不同碳源的MRS培養(yǎng)基溶液,121 ℃,15 min高壓蒸汽滅菌備用。不同碳源分別包括2%添加量的葡萄糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、L-阿拉伯糖、乳果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇。

篩選方法參照張芳[11]的方法,略有改動(dòng)。將植物乳桿菌581菌株以1%的接種量接種到含有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，在37 ℃下培養(yǎng),于培養(yǎng)的0～10 h每隔2 h取樣測定光密度值(OD600),培養(yǎng)10 h時(shí)取樣測定pH,每個(gè)樣品三次重復(fù)。

1.2.2 片劑制備 植物乳桿菌581經(jīng)37 ℃發(fā)酵16 h,-30 ℃凍干72 h后制成菌粉,采用平板培養(yǎng)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。將植物乳桿菌581(2×1010CFU/片)、低聚果糖和其他輔料(見表3)混合后,用HSZP35高速壓片機(jī)(轉(zhuǎn)速15 r/min)制成片劑(2.0 g/片,1.7 mm)。

表2 產(chǎn)品配方表Table 2 Product formulation table

1.2.3 通便功能實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證含有植物乳桿菌581的產(chǎn)品是否具有潤腸通便、緩解便秘的功效,研究采用復(fù)方地芬諾酯建立的小鼠便秘模型,參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》中相應(yīng)方法[12]開展通便功能實(shí)驗(yàn)。

動(dòng)物飼養(yǎng)保持環(huán)境溫度為(21±2) ℃,濕度為30%～70%,12 h光照交替,自由攝入小鼠維持飼料和飲水。昆明小鼠自購入起適應(yīng)7 d后,按體重進(jìn)行隨機(jī)分組,共分為4組,每組12只。分組包括對照組、模型組、益生菌組、片劑產(chǎn)品組。其中,益生菌組灌胃植物乳桿菌581,灌胃劑量為6.67×109CFU/kg小鼠體重。片劑產(chǎn)品組灌胃片劑產(chǎn)品,灌胃劑量為0.67 g/kg小鼠體重(其中所含植物乳桿菌581劑量同益生菌組),相當(dāng)于人體服用劑量1片/d。對照組和模型組每天灌胃與受試組等體積的0.85%的生理鹽水溶液。受試樣品給喂7 d后,除對照組外,其余各處理組給予復(fù)方地芬諾酯懸液(10 mg/kg小鼠體重),0.5 h后,灌胃墨汁,觀察并記錄每只小鼠的首粒排黑便時(shí)間、6 h內(nèi)排黑便的粒數(shù)及重量。實(shí)驗(yàn)期間每7 d對小鼠體重進(jìn)行檢測。

1.2.4 產(chǎn)品的穩(wěn)定性測定 對壓片產(chǎn)品進(jìn)行貯藏穩(wěn)定性測試。片劑產(chǎn)品用鋁箔袋真空熱封包裝后,分別放置于4 ℃和室溫28 ℃環(huán)境下貯存。每月測定壓片產(chǎn)品的活菌數(shù)、水分含量、水分活度及其他感官指標(biāo),連續(xù)測定6個(gè)月,每個(gè)樣品三次重復(fù)。

1.2.5 產(chǎn)品穩(wěn)定性指標(biāo)測定 將壓片產(chǎn)品用研缽研碎后,稱取1 g溶于9 mL 0.85%生理鹽水中,取1 mL依次進(jìn)行梯度稀釋,稀釋至10-7,取100 μL于含有固體MRS培養(yǎng)基的平皿進(jìn)行涂布,放于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,計(jì)數(shù);稱取1 g用水分活度儀檢測壓片產(chǎn)品水分活度;稱取0.5 g用水分含量測定儀檢測壓片產(chǎn)品水分含量。每個(gè)樣品三次重復(fù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 測定指標(biāo)均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。顯著性分析采用SPSS 17.0軟件中的Duncan’s多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌581對不同益生元的利用特性

比較植物乳桿菌581對不同種類益生元的利用特性。由圖1可知,植物乳桿菌581對低聚果糖和低聚異麥芽糖的利用效果最好,生長速率最快,其次為甘露醇和低聚半乳糖。L-阿拉伯糖、赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖醇基本不能被植物乳桿菌581有效利用。

圖1 不同益生元對植物乳桿菌581生長曲線的影響Fig.1 Effect of different prebiotics on the growth curve of L. plantarum 581

植物乳桿菌581是一株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的乳酸菌。發(fā)酵終點(diǎn)的產(chǎn)酸強(qiáng)度同樣也反應(yīng)了菌株的生長情況。由圖2可知,植物乳桿菌581對低聚果糖、低聚異麥芽糖、甘露醇的利用效果最好,終點(diǎn)酸度最低,與生長曲線結(jié)果基本一致。說明低聚果糖促進(jìn)植物乳桿菌581生長的能力較優(yōu),且經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研低聚果糖具有一定的潤腸通便功能[13-15],基于581菌株對不同種類益生元的利用特性及成本等其他因素綜合考量,選取低聚果糖作為與581進(jìn)行配伍的益生元,并完成產(chǎn)品配方制定與壓片產(chǎn)品試制。

圖2 不同益生元對植物乳桿菌581產(chǎn)酸情況的影響Fig.2 Effect of different prebiotics on the acid production of L. plantarum 581注:標(biāo)注*表示與葡萄糖相比具有顯著性差異,P<0.05; 標(biāo)注**表示與葡萄糖相比具有顯著性差異,P<0.01。

2.2 通便功能實(shí)驗(yàn)

由表3可知,各處理組小鼠體重與對照組相比均無顯著差異(P>0.05),說明壓片產(chǎn)品對小鼠生長狀況無影響。

表3 不同處理組小鼠的體重變化情況Table 3 Body weight change of mice in different treatment groups

受試樣品給喂7 d后,進(jìn)行小鼠排便情況測定。由表4可知,與對照組相比,模型組小鼠的首次排黑便時(shí)間極顯著增加(P<0.01),6 h排黑便粒數(shù)和排黑便質(zhì)量降低(P=0.085,P=0.078),表明采用復(fù)方地芬諾酯懸液灌胃制造便秘模型造模成功。

表4 不同處理組小鼠的排便情況Table 4 Defecation of mice in different treatment groups

與模型組相比,灌胃益生菌與灌胃益生菌片劑產(chǎn)品的小鼠首次排黑便時(shí)間顯著降低(P<0.05,P<0.01),同時(shí)6 h排黑便粒數(shù)顯著增加(P<0.05)。其中,片劑產(chǎn)品組的首次排黑便時(shí)間、6 h排黑便粒數(shù)和質(zhì)量三項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于益生菌組。表明采用經(jīng)過篩選的益生元與益生菌復(fù)配產(chǎn)品的功能更優(yōu)于單獨(dú)益生菌的使用。

2.3 片劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性跟蹤

檢測含有植物乳桿菌581與低聚果糖的益生菌片劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性。在0～6個(gè)月的儲(chǔ)藏期限內(nèi),產(chǎn)品的外觀、色澤均無明顯變化。

產(chǎn)品的水分含量與水分活度在4 ℃與28 ℃貯藏條件下均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(表5)。產(chǎn)品的活菌數(shù)在4 ℃貯藏條件下基本無顯著變化,始終維持在1×1010CFU/g左右。在28 ℃儲(chǔ)藏條件下,活菌數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長而降低,至6個(gè)月時(shí)活菌數(shù)降至103CFU/g(表6)。說明含有植物乳桿菌581的益生菌片劑產(chǎn)品適宜在4 ℃進(jìn)行貯藏。

表5 0～6月片劑產(chǎn)品水分含量與水分活度的變化情況Table 5 Changes in moisture content and water activity of tablet products of 0～6 months

3 討論與結(jié)論

2011年國際益生菌與益生元研究會(huì)對益生元進(jìn)行較詳細(xì)的闡述,認(rèn)為益生元主要特點(diǎn)為不被消化、能被腸道細(xì)菌發(fā)酵、能選擇性地刺激腸道菌群的生長和(或)活性[13]。益生元的種類多樣,不同益生元促進(jìn)菌株生長狀況存在差異,本研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌581對低聚果糖的利用率較高。低聚果糖一般由1～3個(gè)果糖基通過糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生產(chǎn)的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等的混合物。研究表明,攝入低聚果糖具有一定緩解便秘的作用,但需達(dá)到一定有效劑量[14]。王宇[15]研究報(bào)道了便秘患者需服用低聚果糖5 g/d,連續(xù)7 d后可顯著改善排便狀況。本研究中低聚果糖服用量相當(dāng)于1 g/d,遠(yuǎn)低于有效劑量。

植物乳桿菌581菌株分離自四川泡菜樣品,本身具有一定的潤腸通便功能。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn),片劑產(chǎn)品組小鼠的首次排黑便時(shí)間、6 h排黑便粒數(shù)、6 h排黑便質(zhì)量均優(yōu)于同等菌濃度的益生菌組,表明低聚果糖能夠促進(jìn)植物乳桿菌581更好的發(fā)揮潤腸通便功能,功能效果更優(yōu)于單獨(dú)益生菌的使用。

對于益生菌類片劑產(chǎn)品而言,保證其功能性的關(guān)鍵是在貨架期內(nèi)保證其足夠的活菌菌數(shù)。FAO與WHO將益生菌定義為“當(dāng)攝入足夠量時(shí)對宿主能發(fā)揮有益功效的一類活的微生物”,其中也強(qiáng)調(diào)了活菌的概念[16]。目前,由于國家相關(guān)法規(guī)的缺乏或不健全,市售的部分益生菌類產(chǎn)品僅以出廠時(shí)活菌數(shù)進(jìn)行標(biāo)示,不能保證儲(chǔ)藏標(biāo)識(shí)條件下貨架期內(nèi)的活菌數(shù);或既缺乏有效劑量的標(biāo)識(shí),也無法保證貨架期內(nèi)可否達(dá)到有效劑量。因此,本研究在完成產(chǎn)品功能性評價(jià)的同時(shí),對產(chǎn)品的穩(wěn)定性也進(jìn)行了研究。

益生菌片劑產(chǎn)品的水分含量,尤其水分活度對產(chǎn)品的穩(wěn)定性有一定的影響。產(chǎn)品中包含的水可分為自由水與結(jié)合水,其中自由水一般指細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間可自由流動(dòng)、參與物質(zhì)代謝并為微生物所利用的水,由水分活度表征[17]。本研究對6個(gè)月儲(chǔ)藏期內(nèi)產(chǎn)品的水分含量與水分活度變化進(jìn)行了追蹤實(shí)驗(yàn),其中產(chǎn)品的水分活度在0.20～0.26之間,期間呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),在28 ℃貯藏條件下,產(chǎn)品活菌數(shù)隨著貯藏周期呈明顯下降趨勢。Lone等[18]針對嗜酸乳桿菌(LA-5)在不同水活度條件下(Aw=0.11、0.22、0.32、0.43)進(jìn)行3個(gè)月的穩(wěn)定性跟蹤,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨水活度的降低菌粉產(chǎn)品的穩(wěn)定性明顯提高。Satu等[19]報(bào)道了鼠李糖乳桿菌LGG在Aw=0.22條件下儲(chǔ)藏14個(gè)月活菌數(shù)下降約3.5個(gè)數(shù)量級(jí),而在Aw=0.11條件下菌數(shù)基本無顯著變化。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道相比較,可以通過降低片劑產(chǎn)品水分活度來增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性。此外,片劑類益生菌產(chǎn)品不同于粉劑產(chǎn)品,其在壓片過程中形成的壓力對菌粉的活力保持存在影響也可能是本研究中產(chǎn)品活菌數(shù)降低的原因之一[20-21]。后續(xù)研究將考慮從多方面進(jìn)行改善,包括優(yōu)化輔料篩選,降低產(chǎn)品水分活度,優(yōu)化壓片工藝,添加壓力緩沖類輔料[22]或優(yōu)化產(chǎn)品包裝工藝與包裝材質(zhì)等,提高貨架期內(nèi)產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

本研究表明,植物乳桿菌581可利用低聚果糖作為碳源來源,在多種益生元中應(yīng)用效果最優(yōu)。以此為依據(jù)選擇低聚果糖為主要配方成分,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,與植物乳桿菌581在體內(nèi)可發(fā)揮協(xié)同作用。以人體服用量為1片/d的劑量進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果表明該片劑產(chǎn)品對小鼠的首次排黑便時(shí)間、6 h排黑便粒數(shù)和質(zhì)量均有顯著改善的效果,具有良好的潤腸通便的功能。本款產(chǎn)品在4 ℃儲(chǔ)存可保證其活菌數(shù)與優(yōu)良的功能性。