胡旭陽,李 維,孔祥東,韓行標,唐云平,余方苗,楊最素,丁國芳

(浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院,浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心,浙江舟山 316022)

海洋活性肽因具有免疫調(diào)節(jié)、舒張血管、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗炎及抗真菌等生理活性,成為目前海洋性功能成分的研究重點之一[1]。酶解法是提取制備海洋活性肽的一種常用方法,利用酶解法提取制備海洋活性肽已成為近年來的研究熱點[2]。Tang等[3]用酶解法提取了日本黃姑魚皮膠原蛋白,發(fā)現(xiàn)其有保濕活性,可用于化妝品行業(yè)。葉盛旺等[4]通過胃蛋白酶從青蛤中制備多肽,驗證其在體外的免疫調(diào)節(jié)作用。Vo等[5]從螺旋藻中用酶解法提取并純化了抗炎多肽。Wang等[6]從牡蠣中提取寡肽,作用于小鼠,發(fā)現(xiàn)有顯著的免疫作用。Ahn等[7]以鮭魚胸鰭副產(chǎn)物為原料,用胃蛋白酶酶解制備了抗炎多肽。Hou等[8]從鱈魚骨架中用胰蛋白酶提取了具有免疫活性的多肽。

日本黃姑魚(Nibeajaponica),俗稱黑毛鲿,隸屬鱸形目、石首魚科、黃姑魚屬,主要分布于中國東海及日本南部海[9]。日本黃姑魚味道鮮美,營養(yǎng)豐富,其鰾是名貴的中藥補品[10-11],魚皮中含有較高的膠原蛋白[12]。其魚肉蛋白質(zhì)含量較高,易被人體消化吸收,但作為蛋白來源用于提取制備免疫活性肽的研究鮮為報道。

本論文利用5種商業(yè)化蛋白酶對日本黃姑魚肉進行酶解,以日本黃姑魚肉多肽對小鼠巨噬細胞RAW 264.7的相對增殖率為指標,篩選出最佳酶種,再經(jīng)單因素實驗和響應(yīng)面試驗確定該酶的最佳酶解條件,以期為日本黃姑魚肉免疫活性肽的制備及進一步研究其免疫調(diào)節(jié)作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

日本黃姑魚 浙江省海洋水產(chǎn)研究所提供;小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7 中科院上海細胞所,由本實驗室傳代培養(yǎng);胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶 北京亞太恒信生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基 Gibco公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO) Sigma公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JJ-2組織攪碎機 上海比朗儀器有限公司;DK-S24水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;CKX41倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司;CF16RXⅡ型高速低溫離心機 日本日立公司;ZHJH-C1209C型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司;Forma3111 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;WRO-70型超純水儀 美國Millipore公司;酶標儀 美國Bio-Rad公司;BSA124S型電子天平 德國SatoriusAG公司;ALPHA 1-4/LDplus型冷凍干燥機 德國CHRIST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 日本黃姑魚肉多肽工藝 日本黃姑魚肉經(jīng)過預(yù)處理后,按一定的料液比加入純水,調(diào)節(jié)pH和酶解溫度,加入一定量的蛋白酶進行酶解。酶解完成后,滅酶活,待酶解液冷卻至室溫,調(diào)節(jié)酶解液的pH至中性。將酶解液離心取上清,冷凍干燥,凍干粉末即為日本黃姑魚肉多肽。

1.2.2 日本黃姑魚肉預(yù)處理 參考丁浩宸等[13]脫脂方法,取一定量的日本黃姑魚,去除魚皮、魚鰭和內(nèi)臟等器官,清洗干凈。用絞碎機絞碎。絞碎的日本黃姑魚肉用95%乙醇,在料液比為1∶6 (m/v)、脫脂溫度為50 ℃的條件下,脫脂2次,每次1 h。將脫脂后的日本黃姑魚肉在4 ℃、12000 r/min預(yù)冷的離心機離心15 min,收集沉淀。用純水將沉淀洗至無乙醇味,凍干后放入-20 ℃冷凍備用。

1.2.3 最佳酶種的篩選 稱量5份10.0 g預(yù)處理過的日本黃姑魚肉,酶解方法參考文獻[14-16]進行實驗,以料液比1∶10 (g/mL)加入純水,每種蛋白酶的酶添加量為1500 U/g,混勻后分別在每種蛋白酶推薦的最適宜溫度和pH條件下(木瓜蛋白酶酶解條件為60 ℃、pH6.0;胰蛋白酶酶解條件為37 ℃、pH8.0;中性蛋白酶酶解條件為45 ℃、pH7.0;堿性蛋白酶酶解條件為45 ℃、pH10.0;胃蛋白酶酶解條件為37 ℃、pH2.0),酶解6 h,酶解完成后在沸水中滅酶活10 min,冷卻至室溫12000 r/min離心15 min,取上清液冷凍干燥。將凍干的酶解產(chǎn)物配成濃度為100 μg/mL溶液,采用MTT法檢測5組酶解產(chǎn)物對RAW 264.7細胞增殖的影響,并計算相對增殖率,篩選出最佳酶解的蛋白酶。

1.2.4 單因素實驗 在1.2.3篩選出最適蛋白酶的情況下,研究影響酶添加量、料液比、酶解溫度、pH和酶解時間對日本黃姑魚肉酶解的影響。酶解的基本條件為加酶量1500 U/g、料液比1∶10 (g/mL)、溫度60 ℃、pH6.0、時間6 h。改變其中的1個條件,分別考察蛋白酶的添加量(500、1000、1500、2000、2500 U/g),料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL),酶解溫度(50、55、60、65、70 ℃),pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)和酶解時間(2、4、6、8、10 h)對酶解效果的影響,MTT法檢測相對增殖率。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)下,以酶解溫度、酶解時間、料液比和pH為工藝參數(shù),設(shè)計四因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗,以日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞的相對增殖率為指標,設(shè)計5個中心點和29個不同組合的試驗,試驗因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞的相對增殖率的測定 參考葉盛旺等[4]方法,稱取一定量的日本黃姑魚肉多肽,用細胞培養(yǎng)液配成100 μg/mL的濃度。采用MTT法檢測其對RAW264.7細胞增殖的影響。按式(1)計算相對增殖率。

相對增殖率(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/空白對照組OD值×100

式(1)

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 8.05b對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

5種蛋白酶酶解產(chǎn)物對RAW 264.7細胞的相對增殖率情況如圖1所示。由圖1可知,木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對RAW 264.7細胞的相對增殖率最高為53.60%,其后依次為中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶,胰蛋白酶酶解產(chǎn)物對RAW 264.7細胞的相對增殖率最低。故選擇木瓜蛋白酶為本實驗最優(yōu)提取酶。

圖1 不同蛋白酶對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.1 Effect of different proteases on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2 單因素實驗

2.2.1 加酶量對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖2所示為加酶量對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。酶添加量由500 U/g增加到2000 U/g時,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞的相對增殖率持續(xù)升高,這是因為酶添加量增加,底物反應(yīng)越徹底,在酶添加量達到2000 U/g時,對RAW 264.7細胞相對增殖率最高。當酶添加量繼續(xù)增加時,底物已經(jīng)充分酶解,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率不再隨著酶添加量的增多而升高,反而有略微下降的趨勢,這可能是生成的多肽被再次酶解導(dǎo)致的。因而最適酶添加量為2000 U/g。

圖2 酶添加量對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2.2 料液比對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖3所示為料液比對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。當料液比為1∶10 (g/mL)時,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率達到最大。料液比在1∶6～1∶14范圍內(nèi)時,隨著料液比的增加,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率先升高后降低。這是由于在一定的范圍內(nèi),增加酶解體系中的料液比,酶與底物接觸逐漸充分,酶解程度不斷增大。但是隨著料液比越來越大,底物被過多稀釋,這反而增大了酶與底物的接觸難度,導(dǎo)致體系酶解不完全,蛋白質(zhì)難以被分解成具有免疫活性的肽[17]。因此,最佳料液比為1∶10 (g/mL)。

圖3 料液比對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.3 Effect of ratios of water to material on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2.3 酶解溫度對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖4所示為酶解溫度對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。溫度由50 ℃升高至60 ℃時,酶解效果越來越好,日本黃姑魚肉酶解多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率越來越高。當酶解溫度在60～70 ℃時,相對增殖率開始下降。這是因為在一定的溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,酶活力開始增大,酶與底物結(jié)合程度開始提高,有利于提取免疫活性肽;但溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,不僅降低了酶活力,而且會引起蛋白質(zhì)的聚集和沉淀作用,使其溶解度下降,不利于提取免疫活性肽[18]。因此,最佳酶解溫度為60 ℃。

圖4 酶解溫度對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.4 Effect of enzymatic temperature on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2.4 pH對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖5所示為pH對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。當pH為6.0時,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率最高,達到58.44%。在pH4.0～8.0的范圍內(nèi),隨著pH的升高,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率先逐漸升高后逐漸降低。pH能影響酶活性部位的解離和底物蛋白的解離,從而直接影響了酶與底物蛋白的結(jié)合與催化,每個催化反應(yīng)都有一個最適的pH[19]。因此,最佳pH為6.0。在細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)液的pH對細胞活力有一定的影響[14],因此,為考慮酶解液中pH對細胞活力產(chǎn)生的影響,將滅酶活后的酶解液調(diào)至中性再進行后期實驗,以防pH對細胞的活力有影響,進而影響各酶解條件的篩選。

圖5 pH對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.5 Effect of pH on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2.5 酶解時間對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖6所示為酶解時間對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。當時間在2～6 h時,酶解產(chǎn)物對RAW 264.7細胞相對增殖率越來越高,當酶解時間達到6 h時,相對增殖率達到最高。當時間在6～10 h時,酶解產(chǎn)物對RAW 264.7細胞相對增殖率開始降低。這可能是因為酶解時間延長,酶解反應(yīng)中一些具有高免疫活性的肽鏈被再次酶解,導(dǎo)致相對增殖率降低[20]。故選擇酶解時間為6 h左右。

圖6 酶解時間對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.6 Effect of enzymatic time on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取料液比、pH、酶解溫度、酶解時間進行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗,以日本黃姑魚肉多肽對小鼠巨噬細胞RAW 264.7的相對增殖率為響應(yīng)值,分析日本黃姑魚肉酶解的最優(yōu)工藝指標。響應(yīng)面試驗的設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results for the Box-Behnken experiment

各因素經(jīng)過回歸擬合后,得到料液比、pH、酶解溫度、酶解時間的二次多項回歸方程為:

相對增殖率=60.42-1.29A+4.64B+0.52C+5.16D-2.16AB+1.88AC-2.70AD-2.66BC-3.71BD-2.31CD-6.37A2-20.68B2-3.46C2-5.09D2。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述,響應(yīng)面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應(yīng)值的影響[21-23]。響應(yīng)面圖曲面坡度陡峭、等高線密集成橢圓形表明兩因素交互影響大,而坡度平緩、等高線呈圓形則表明兩因素之間交互影響小[24-25]。各因素交互作用對小鼠巨噬細胞RAW 264.7相對增殖率的影響如圖7所示。由圖7可以直觀地看出,各試驗因素的交互作用不顯著,與方差分析結(jié)果一致。

圖7 各因素之間交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface diagrams for interaction of various factors

2.4 驗證實驗

經(jīng)Design Expert 8.05b軟件分析得到的最佳酶解條件為料液比1∶11.2 (g/mL)、pH6.1、酶解時間5.4 h、酶解溫度58.8 ℃。在此條件下,日本黃姑魚肉多肽對小鼠巨噬RAW 264.7細胞增殖率的預(yù)測值為62.3%。為了驗證響應(yīng)面法的可行性,采用得到的最佳提取條件進行日本黃姑魚肉多肽對小鼠巨噬細胞RAW 264.7的增殖率的驗證實驗,同時考慮到實際操作等因素,修正工藝參數(shù)為:酶解時間5.4 h、料液比1∶11 g/mL、酶解溫度59 ℃、pH為6,進行3次平行實驗得到的增殖率為61.8%±0.5%,與預(yù)測值62.3%無顯著性差異。因此,通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取日本黃姑魚肉多肽的酶解條件是可行的,得到的日本黃姑魚肉多肽提取條件的回歸模型較可靠。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)實驗分析,確定提取日本黃姑魚肉多肽所用的蛋白酶為木瓜蛋白酶。通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計得到了日本黃姑魚肉多肽提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶11 (g/mL)、pH為6、酶解時間5.4 h、酶解溫度59 ℃。通過驗證實驗所得得到的增殖率為61.8%±0.5%,與模型預(yù)測值接近,證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取日本黃姑魚肉多肽是準確可行的,為日本黃姑魚魚肉提取免疫活性肽奠定基礎(chǔ),為進一步研究其免疫調(diào)節(jié)作用機制提供參考。

本研究探討了日本黃姑魚肉免疫多肽的制備工藝,其實質(zhì)就是酶反應(yīng)條件對產(chǎn)物活性成分的影響。只有調(diào)節(jié)合適的pH、酶解溫度和酶解時間,用適當?shù)牡鞍酌高M行酶解,才可以產(chǎn)生有生理活性的免疫活性肽[26]。經(jīng)大量免疫活性肽研究中發(fā)現(xiàn)免疫活性肽通常具有疏水性氨基酸,其活性與母體蛋白的氨基酸組成、亞基序列、空間結(jié)構(gòu)有關(guān)[27]。因此,調(diào)節(jié)酶反應(yīng)條件達到最佳的酶解效果,提取的日本黃姑魚肉多肽才能具有最強的免疫活性。