張沙沙,蔡 威,吳冬陽,崔 斌,沙如意,毛建衛(wèi)
(浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物 加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同中心,浙江杭州 310023)
細(xì)菌纖維素(Bacteriacellulose,BC)是由醋酸菌屬(Acetobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)和八疊球菌屬(Sarcina)中的一些特殊微生物所產(chǎn)生的纖維素。目前,已有大量利用葡萄糖酸醋桿菌屬菌種生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究報道,目前極少有從葡萄糖酸醋桿菌屬中分離出來并被命名為Komagataeibacter屬菌種生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究報道。研究利用Komagataeibacter屬菌種(如Komagataeibacterxylinus)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素,可以為細(xì)菌纖維素的發(fā)酵生產(chǎn)提供更廣泛的菌種資源。
相比于其他纖維素,細(xì)菌纖維素是一種“純”纖維素,具有優(yōu)良的特性,例如高結(jié)晶度、高純度、高持水性等[2]。BC具有廣泛應(yīng)用,在食品行業(yè)中,BC被稱為椰果(Nata),常用于乳制品和飲料中,具有熱量低、口感好、不易被人體消化等特征,可以促進(jìn)腸道蠕動達(dá)到減肥的效果,預(yù)防肥胖并發(fā)癥[3],同時可在肉腸中代替肉類以減少產(chǎn)品的熱量[4]。在醫(yī)藥行業(yè)中BC具有改善人體消化環(huán)境、減少便秘、降低膽固醇、預(yù)防癌癥等作用,還可以用作醫(yī)藥輔料、人工角膜和人工血管等[5]。在紡織行業(yè)中,由于細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)與植物纖維素結(jié)構(gòu)相似,因此細(xì)菌纖維素可作為人造纖維材料用于制作衣物等[6]。細(xì)菌纖維素在其它領(lǐng)域上的應(yīng)用也正在研究開發(fā)中。
目前BC的發(fā)酵碳源大多為葡萄糖,生產(chǎn)成本高,極大限制了細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)規(guī)模。以水果、廢棄纖維素、低值淀粉等農(nóng)副加工副產(chǎn)物為主,通過發(fā)酵生產(chǎn)BC為突破口,可以為細(xì)菌纖維素的發(fā)酵尋找新的研究方向[7]。木薯是一種來源廣泛且價格低廉的原料,其主要成分為淀粉,在鮮木薯中淀粉含量大概為25%~30%。因而,木薯是一種較實(shí)惠的農(nóng)作物,相比于葡萄糖而言,更適合用于生產(chǎn)大量細(xì)菌纖維素所需要的能源物質(zhì)。但是,木薯中含有一些其他的營養(yǎng)物質(zhì),例如蛋白質(zhì)、微量元素等,這些物質(zhì)可能會促進(jìn)或者抑制細(xì)菌產(chǎn)纖維素能力,具體情況還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究主要以木薯全粉為原料,經(jīng)過預(yù)處理、酶解、發(fā)酵等制備BC,對影響細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響因素進(jìn)行研究,同時研究發(fā)酵過程中BC的產(chǎn)量與還原糖消耗以及pH的關(guān)系,并對BC的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行分析,旨在為BC的生產(chǎn)提供新的數(shù)據(jù)支撐[8]。
Komagataeibacterxylinus實(shí)驗(yàn)室紅茶菌中分離,并保藏于Genebank數(shù)據(jù)庫(GenBank accession number MK386709);氫氧化鈉、冰醋酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡萄糖 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司;無水乙醇 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;干燥木薯粉 廣西玉林市木薯基地;液化酶、糖化酶(酶活力(U/g)≥100000.0) 杰能科(中國)生物工程有限公司;硫酸鎂、磷酸氫二鉀、纖維素酶(酶活力(U/g)≥15000.0) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;JEM-1011透射電鏡 日本電子公司;PHS-3CPH計 杭州齊威儀器有限公司;FA2004電子天平 上海舜宇橫平科學(xué)儀器有限公司;傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克儀器公司;KQ-500E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Q500-V20.6熱重分析儀 美國TA儀器;D8ADVANCE型X射線衍射儀 日本島津公司;VARIO MICRO元素分析儀 瑞士大昌華嘉集團(tuán)公司。
1.2.1 木薯水解液制備 稱取一定量的木薯粉,烘至恒重,放入燒杯中,木薯粉∶水為1∶30,調(diào)pH為6,常溫超聲30 min;加入1%液化酶95 ℃水浴3 h。反應(yīng)結(jié)束后用HCl調(diào)pH為4.0;向液化水解液中加入1%糖化酶和1%纖維素酶,將反應(yīng)器放入65 ℃恒溫水浴鍋中,反應(yīng)72 h。反應(yīng)完畢后利用NaOH溶液中和水解液至pH=7,抽濾得到濾液后減壓蒸餾,用DNS法測定濃縮液的還原糖含量[9]。處理后放入4 ℃冰箱中備用。
1.2.2 培養(yǎng)基配制 種子培養(yǎng)基:葡萄糖1 g,酵母膏1 g,乙醇3.5 mL,pH6,水100 mL。
菌種活化培養(yǎng)基:酵母粉1 g,水100 mL,葡萄糖2 g,蛋白胨1 g。
發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉1 g,乙醇3.5 mL,水100 mL,pH6,木薯水解液若干,MgSO41 g,K2HPO40.1 g。
1.2.3 BC的發(fā)酵Komagataeibacterxylinus菌種活化:從-80 ℃冰箱中取出一支菌種置于已滅菌的Komagataeibacterxylinus菌種活化培養(yǎng)基中,30 ℃,160 r/min,搖床培養(yǎng)48 h。將已活化好的菌種按一定的接種量加入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中。30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),測定發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量、還原糖含量和pH。
1.2.4 木薯水解液發(fā)酵生產(chǎn)BC單因素實(shí)驗(yàn) 控制不同的初始pH、木薯水解液添加量、裝液量、接種量、溫度5個因素,研究其對BC產(chǎn)量的影響。
1.2.4.1 溫度對BC產(chǎn)量的影響 將菌種接入到已滅菌好的100 mL含有5%木薯水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基(初始pH6.0)中,分別放入20、25、30、35、40、45 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d,測定BC產(chǎn)量。
1.2.4.2 裝液量對BC產(chǎn)量的影響 選擇50、75、100、125、150 mL已配制好且滅菌過的5%木薯水解液發(fā)酵培養(yǎng)基加入到250 mL錐形瓶中,接入5%菌種,初始pH6.0,溫度30 ℃,培養(yǎng)7 d,測定BC產(chǎn)量。
1.2.4.3 初始pH對BC產(chǎn)量的影響 調(diào)節(jié)含有5%木薯水解液發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量75 mL)的初始pH分別為4、5、6、7、8這5個梯度,接入5%菌種,溫度30 ℃,培養(yǎng)7 d,測定BC產(chǎn)量。
1.2.4.4 木薯水解液添加量對BC產(chǎn)量的影響 選擇1%、2%、3%、4%、5%、6%添加量的木薯水解液于75 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,接入5%菌種,初始pH6,溫度30 ℃,培養(yǎng)7 d,測定BC產(chǎn)量。
1.2.4.5 接種量對BC產(chǎn)量的影響 選擇3%、6%、9%、12%、15%已活化好的菌種接入已配制好且滅菌過的75 mL含有5%木薯水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中,初始pH6,溫度30 ℃,培養(yǎng)7 d,測定BC產(chǎn)量。
1.2.5 分析方法
1.2.5.1 還原糖含量的測定 分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(1 mg/mL)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于15 mL試管中,用蒸餾水補(bǔ)足至1.0 mL,分別準(zhǔn)確加入DNS試劑1.5 mL,沸水浴加熱5 min,冰水浴冷卻,用水補(bǔ)足到10 mL,在540 nm波長下測定吸光度,制作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。以還原糖含量x(mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度y為縱坐標(biāo),得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=1.623x-0.1333,相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。利用DNS試劑測定發(fā)酵液中的還原糖含量(g/L)。
1.2.5.2 BC產(chǎn)量的測定 對發(fā)酵培養(yǎng)基利用濾紙過濾,將得到的白色凝膠狀薄膜產(chǎn)物浸入0.1%的NaOH溶液中煮沸30 min,以洗去其表面殘留的菌種,再用去離子水洗去產(chǎn)物表面殘留的NaOH溶液,最后再用稀醋酸溶液調(diào)pH為中性,65 ℃烘干至恒重,稱量得到干重(g),將干重除以相應(yīng)的裝液量得到BC產(chǎn)量(g/L)。
1.2.5.3 pH測定 取5 mL體積的發(fā)酵液,利用pH計測定pH。
1.2.6 細(xì)菌纖維素的理化表征
1.2.6.1 細(xì)菌纖維素含水率的測定 將處理好的細(xì)菌纖維膜,拭干膜表面水分后,稱重記錄為M濕1(g)。然后再將膜放入65 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中至恒重[10],記錄重量為M干。
含水率(W1,%)的計算公式如下:
1.2.6.2 細(xì)菌纖維素復(fù)水率的測定 將已經(jīng)干燥好的細(xì)菌纖維素放入水中24 h,使其充分吸收水分,拭干膜表面的水分后,電子天平稱重[10],記錄為M濕2。
復(fù)水率(W2,%)計算公式如下:
1.2.6.3 元素分析 取細(xì)菌纖維素樣品研磨成粉末狀,并準(zhǔn)確稱量18~22 mg于錫箔紙中,抽真空干燥后進(jìn)行C、H、O、N、S的元素分析,計算各元素的含量。
1.2.6.4 紅外光譜分析 采用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR),將細(xì)菌纖維素充分干燥后粉碎,與干燥的KBr粉末充分研磨混合、壓片;利用分辨率為4 cm-1,掃描波長范圍為400~4000 cm-1進(jìn)行分析[10]。
1.2.6.5 熱重(TGA)分析 將細(xì)菌纖維素在鼓風(fēng)干燥箱中充分干燥至恒重后,磨碎,稱量10 mg左右于Al2O3小坩堝中,放入熱重分析儀中在空氣氣氛下檢測[3]。升溫速度:10 ℃/min;溫度范圍:50~900 ℃;保護(hù)氣(空氣):150 mL/min。
1.2.6.6 掃描電鏡觀察 將干燥好的細(xì)菌纖維素樣品剪成直徑為0.1 cm左右的小碎片,再將小碎片置于真空鍍膜機(jī)中對其表面噴金15 s,噴金后的樣品于掃描電鏡中5 kV電壓下觀察其結(jié)構(gòu)[3]。
1.2.6.7 X-射線衍射分析 將細(xì)菌纖維素充分干燥后,磨碎,取適量的粉末于樣品板上。Cu靶,10 kV高壓,管流為50 mA,2θ=5~50 °掃描,得到XRD光譜[11]。
實(shí)驗(yàn)組重復(fù)數(shù)n=3,采用Origin 8.5繪制圖表。
木薯水解液經(jīng)過預(yù)處理、酶解等一系列過程,可以作為培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)質(zhì)碳源。細(xì)菌纖維素在生產(chǎn)期間受到很多環(huán)境因素的影響,首先考察培養(yǎng)基的初始pH、溫度、接種量、裝液量、木薯水解液添加量等對細(xì)菌纖維素生產(chǎn)的影響。
2.1.1 溫度對BC產(chǎn)量的影響 如圖1所示,隨著溫度的上升,細(xì)菌纖維素呈先增加后下降的趨勢,在30 ℃時產(chǎn)量達(dá)最高值,40 ℃后將不再生產(chǎn)細(xì)菌纖維素,因此,細(xì)菌纖維素的最適生產(chǎn)溫度為30 ℃,這與陳慧慧等[20]的研究結(jié)果相一致。
圖1 溫度對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of temperature on bacterial cellulose production
2.1.2 裝液量對BC產(chǎn)量的影響 由圖2可知,裝液量在75 mL時,細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量最高,綜合考慮,其原因是50 mL裝液量的總營養(yǎng)物質(zhì)在發(fā)酵過程中被快速消耗完畢導(dǎo)致后期的生產(chǎn)基本停止,75 mL之后隨著裝液量的增加細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量下降主要是由于細(xì)菌纖維素的生長需要耗氧,培養(yǎng)液體表面積比越大其本身的溶氧量越小,不利于醋酸菌生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。最優(yōu)裝液量在75 mL,這與周艷等[19]的研究相同。
圖2 裝液量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of fermentationbroth volume on bacterial cellulose production
2.1.3 初始pH對BC產(chǎn)量的影響 從圖3中明顯得出,在初始pH為6時所得的BC產(chǎn)量最高,BC產(chǎn)量從初始pH為4時隨著pH上升而上升,初始pH6以后隨著pH的增大而減小,可能是醋酸菌的生長需要微酸性環(huán)境且由于自身的生長產(chǎn)生大量的醋酸迫使環(huán)境pH下降,過低的pH又會抑制醋酸菌的生命活動,因此在低的初始pH反而不利于細(xì)菌纖維素的生長,反之,過高的初始pH也不利于醋酸菌的生長。產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌種,如木醋桿菌適應(yīng)于酸性環(huán)境生長,但過酸的環(huán)境不利于其生長發(fā)育從而抑制了細(xì)菌纖維素的產(chǎn)生,故最適初始pH在6,這與仲華維等的研究相同[17]。
圖3 初始pH對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of initial pH value on bacterial cellulose production
2.1.4 木薯水解液添加量對BC產(chǎn)量的影響 如圖4所示,在5%的木薯水解液添加量下得到的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量是最高的,隨著木薯水解液的添加量的繼續(xù)上升,細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量反而下降,主要是因?yàn)榇姿峋軌虼x碳源產(chǎn)生乙酸,使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH下降,抑制了BC的合成,由圖可得此種醋酸菌適合在5%的木薯水解液下生產(chǎn)細(xì)菌纖維素,較高的水解液不利于BC的生產(chǎn)。細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨著還原糖濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,這是因?yàn)檫€原糖作為細(xì)菌生命活動中不可或缺的能源和營養(yǎng)物質(zhì),被微生物快速的用于菌體生長進(jìn)而促進(jìn)纖維素的生產(chǎn),但還原糖濃度的增加也會促進(jìn)酸的生產(chǎn),過量酸反而抑制了菌體的生長從而限制了細(xì)菌纖維素的合成,本實(shí)驗(yàn)最適木薯水解糖液濃度為5%,相當(dāng)于3%葡萄糖量。
圖4 木薯水解液添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of cassava hydrolysate addition on bacterial cellulose production
2.1.5 接種量對BC產(chǎn)量的影響 如圖5所示,隨著接種量的增加,BC產(chǎn)量也在隨之增加,但在6%以后的上升較平穩(wěn)。接種量的大小會影響木醋桿菌的生長、繁殖、代謝的速度,接種量過大,會使得底物在前期過快消耗,不利于后期代謝產(chǎn)物積累;接種量過小,會延長發(fā)酵時間,對細(xì)菌纖維素的產(chǎn)生帶來不利影響,最優(yōu)菌種添加量為6%,這與杜倩雯等[18]的研究結(jié)果相一致。
圖5 接種量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inoculum size on bacterial cellulose production
如圖6所示,發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵天數(shù)的增加培養(yǎng)液中還原糖含量和pH呈現(xiàn)降低的趨勢。相反隨著發(fā)酵天數(shù)的增加BC的產(chǎn)量呈現(xiàn)上升的趨勢,在第4~8 d的生長速率最快。在第1~3 d的時候pH下降最快,主要是由于前三天菌種處于增值階段,在其生長分裂過程中消耗還原糖產(chǎn)生酸導(dǎo)致pH快速下降;在第1、2、3 d主要是細(xì)菌的增殖階段,4、5、6、7、8 d有一個較高的轉(zhuǎn)化率,發(fā)酵生產(chǎn)過程中可以利用增加這一階段的時間從而達(dá)到增加產(chǎn)量的目的,在第8 d以后轉(zhuǎn)化率漸漸下降,主要是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中還原糖的大量消耗,在發(fā)酵過程中,可以在第8 d通過加糖液可以維持生產(chǎn)BC。
圖6 細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)動力學(xué)Fig.6 Dynamics of bacterial cellulose production
如圖7所示,木薯水解液生產(chǎn)細(xì)菌纖維素含水率96%~98%,復(fù)水率50%~58%。利用以上單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌纖維素,在第9 d時的BC產(chǎn)量為5.75 g/L。隨著BC產(chǎn)量的上升含水率和復(fù)水率也在逐漸增大,主要是由于其內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對水分子的鎖水能力的加強(qiáng)。
圖7 細(xì)菌纖維素的含水率與復(fù)水率Fig.7 Moisture content and rehydration rate of bacterial cellulose
2.4.1 元素分析結(jié)果 如表1,木薯水解液原料發(fā)酵生產(chǎn)所得的細(xì)菌纖維素主要由C、H、O三種元素構(gòu)成,這三種元素占總質(zhì)量的98%以上。且C、H、O元素基本符合分子式(C6H10O5)n。
表1 元素分析結(jié)果Table 1 Elemental analysis results
2.4.2 紅外分析 如圖8,木薯水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素,在1070 cm-1處為C-O鍵的伸縮振動,是纖維素的特征峰;在1566 cm-1為C-H鍵的伸縮振動;在2929 cm-1為CH2-CH伸縮振動;在3358 cm-1處為分子間氫鍵引起的O-H基的伸縮振動;這與陳慧慧等[12]的結(jié)果一致。通過紅外分析得到了具有纖維素所特有的特征峰,說明其含有與纖維素相同的基團(tuán),這與Chandrasekaran等[21]所得細(xì)菌纖維素圖譜基本相同。
圖8 紅外光譜分析Fig.8 Infrared spectrum analysis
2.4.3 熱重分析 如圖9,以木薯水解液發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素的Mass曲線和DTG曲線可以明顯的看出,在0~170 ℃范圍內(nèi)質(zhì)量有一個緩慢下降的趨勢,這主要是因?yàn)榧?xì)菌纖維素含有一定的水分引起的;在170~320 ℃內(nèi)細(xì)菌纖維素在分解過程中進(jìn)行了各種物理化學(xué)反應(yīng),在分解過程中放了大量的熱,所以質(zhì)量出現(xiàn)了急劇下降,失重32.33%;最快分解溫度在290 ℃左右;在320~500 ℃也出現(xiàn)了較大的失重,質(zhì)量減少了19.58%,是由于細(xì)菌纖維素到達(dá)了煅燒階段;最快分解溫度在470 ℃左右。在500~900 ℃后曲線緩慢失重,剩余20%左右是灰燼。這與杜倩雯等[13]的研究結(jié)果相一致。從細(xì)菌纖維素的DTC曲線可以看出在處理階段溫度不能超過170 ℃,這與Costa等[22]的研究結(jié)果相一致。
圖9 Mass-DTG圖譜曲線Fig.9 Spectrum curve
2.4.4 掃描電鏡結(jié)果 如圖10,由掃描顯微鏡可以看出,利用木薯水解液所培養(yǎng)得出的細(xì)菌纖維素微管束直徑不到200 nm,屬于納米級的纖維素,而棉花的纖維素的直徑在10~100 μm,人造纖維的最小直徑在1 μm左右,通過掃描電鏡可以看出細(xì)菌纖維素表面有很多小孔,這是細(xì)菌纖維素膜有較高的持水性與復(fù)水性的原因。這與任澤祺等[14]的研究結(jié)果基本一致。
圖10 掃描電鏡圖譜分析Fig.10 Scanning electron microscope analysis
圖11 XRD晶體衍射Fig.11 XRD crystal diffraction
利用單因素實(shí)驗(yàn)確定以木薯水解液發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的最優(yōu)條件為:溫度30 ℃、裝液量75 mL、初始pH6.0、木薯水解液添加量3%、接種量6%;在細(xì)菌纖維素發(fā)酵過程中,所得的細(xì)菌纖維素含水率為96%~98%,復(fù)水率為50%~58%,具有高的絡(luò)合水能力。元素分析表明細(xì)菌纖維素主要有C、H、O三種元素組成,紅外光譜分析驗(yàn)證了細(xì)菌纖維素的特征吸收峰。差熱分析表明細(xì)菌纖維素的最大失重溫度為290 ℃,熱穩(wěn)定性較好,表明這種細(xì)菌纖維素在一些耐高溫材料中有很重要的應(yīng)用價值。掃描電鏡結(jié)果表明細(xì)菌纖維素是一種網(wǎng)狀納米結(jié)構(gòu),是由高密度的纖維絲相互纏繞而成,并具有較大的網(wǎng)格,可以通過技術(shù)手段將藥品絡(luò)合在細(xì)菌纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中,將其應(yīng)用在醫(yī)用輔料中。XRD晶體衍射進(jìn)一步表明制備的細(xì)菌纖維素有高的結(jié)晶度,可用作穩(wěn)定的高分子材料。