胡秀虹,李 培,2,鄧先銀,王 翔,2,*,張廷輝

(1.凱里學(xué)院大健康學(xué)院,貴州凱里 556011; 2.黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心,貴州凱里 556011; 3.黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,貴州凱里 556011)

韭菜根是百合科蔥屬多年生草本植物寬葉韭(AlliumhookeriThwaites)(又稱(chēng)大葉韭)的肉質(zhì)根,其味辛、性溫,富含胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分及硒、鋅、錳、鈣、鐵等多種人體必需的微量元素,有溫中開(kāi)胃、行氣活血、補(bǔ)腎助陽(yáng)等功效[1-3]。腌韭菜根是貴州黔東南的一款地方特色食品,是采集貴州境內(nèi)原生態(tài)韭菜根,經(jīng)洗凈曬干后拌以輔料或腌制、罐裝,味道非常鮮美[4-6]。近年來(lái),隨著貴州經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,旅游業(yè)及我國(guó)大健康產(chǎn)業(yè)快速興起,韭菜根原生態(tài)食品以其保健功效、獨(dú)特的風(fēng)味,逐漸得到推廣和人們的認(rèn)可。

然而,韭菜根原料水分含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富,極易因滋生微生物而腐敗,且韭菜根加工所用輔料種類(lèi)較多、來(lái)源復(fù)雜,生產(chǎn)企業(yè)基礎(chǔ)薄弱、環(huán)境條件差、技術(shù)落后,生產(chǎn)過(guò)程中的微生物源頭和二次污染均難以控制。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7-9],致使蔬菜腌制品腐敗的微生物主要是芽孢桿菌屬和酵母菌,其中大多數(shù)為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。添加防腐劑是目前市場(chǎng)上最常使用的防腐保鮮方法之一,防腐劑能抑制食品中微生物的生長(zhǎng)繁殖,防止食品變質(zhì)腐敗,從而延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期和貨架期[10-11]。目前,關(guān)于韭菜根腌制品中腐敗微生物的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道,故本研究以脹袋變質(zhì)的真空包裝韭菜根為原料,從中分離篩選出優(yōu)勢(shì)腐敗菌,通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)和16S rRNA基因序列分析鑒定引起真空包裝韭菜根變質(zhì)腐敗的主要微生物,并考察幾種常用防腐劑對(duì)其抑制作用,以期為腌韭菜根生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腌韭菜根(原材料經(jīng)滅菌真空包裝后脹袋變質(zhì)) 貴州麻江裕沃生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient Agar,NA)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient broth,NB)培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;防腐劑(EDTA、苯甲酸鈉、焦亞硫酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉,均為食品級(jí)) 南通奧凱生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;瓊脂糖 上海玉博生物科技有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)、1492R(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) 上海生工生物工程股份有限公司。

SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái) 鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司;GZX-158A型智能光照培養(yǎng)箱、LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海中安醫(yī)療器械廠(chǎng);DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠(chǎng);Gel DOC XT凝膠成像系統(tǒng)儀 美國(guó)BIO-RAD;2720 thermal cyclerPCR儀 Applied Biosystems;倒置光學(xué)顯微鏡 日本Olympus;S-3400N掃描電鏡 日本日立公司;LGJ-100四環(huán)冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腐敗細(xì)菌的分離純化與篩選 在無(wú)菌操作下,分別從5包脹袋變質(zhì)的腌制韭菜根中隨機(jī)取樣25 g,剪碎,放入裝有225 mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中,用無(wú)菌均質(zhì)器拍擊均質(zhì)5 min(拍擊速度為8次/s),制成1∶10的樣品勻液。將樣液按10倍依次進(jìn)行梯度稀釋,分別從10-2、10-3樣液中吸取0.1 mL置于NA培養(yǎng)基上涂布,37 ℃培養(yǎng)24 h,從NA平板上挑取典型生長(zhǎng)的單菌落并反復(fù)劃線(xiàn)純化,獲得單菌株。將分離純化得到的各菌株平板活化培養(yǎng)12 h,挑起菌體用無(wú)菌水制成菌懸液,使菌體濃度約為105～106cfu/mL。

將滅菌后的韭菜根浸于各單菌種菌懸液中,10 s后取出晾干,再置于無(wú)菌袋中真空包裝,以未接腐敗菌的韭菜根作對(duì)照,37 ℃恒溫保存20 d。從是否發(fā)生脹袋及韭菜根感官變化方面進(jìn)行比較,使韭菜根樣品較快腐敗的接種菌株作為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

1.2.2 腐敗細(xì)菌的菌種鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定 參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[12]操作,將已純化的菌株接種至NA培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察其菌落形態(tài)特征并進(jìn)行革蘭氏染色及芽孢染色試驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[13]制備細(xì)菌掃描電鏡樣品,觀察菌體形態(tài)。參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[14]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]進(jìn)行部分生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 16S rRNA基因序列測(cè)定 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作提取細(xì)菌基因組DNA,采用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和片段大小。采用通用引物27F和1492R,以細(xì)菌基因組DNA為模板,進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL):基因組DNA 0.5 μL,10×Buffer(Mg2+)2.5 μL,引物(20 pmol/μL)各0.5 μL,Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL,加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用GenBank中的Blast進(jìn)行同源性比較,通過(guò)Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì),MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 防腐劑對(duì)腐敗細(xì)菌的抑制研究 根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[16]和相關(guān)報(bào)道結(jié)果[10],選擇苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、EDTA、山梨酸鉀、焦亞硫酸鈉作為防腐劑,以無(wú)菌生理鹽水配制質(zhì)量濃度為500 μg/mL的防腐劑母液,0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌,結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)使用情況,防腐劑的名稱(chēng)及具體添加濃度如下:

比濁法[10]:將試驗(yàn)的各菌株活化培養(yǎng)后用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋,使培養(yǎng)基中的菌株初始菌量為500 CFU/mL,按表1各防腐劑的添加濃度加入一定量的防腐劑母液至培養(yǎng)基中,將其置于37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)24 h,以接種菌株但不加防腐劑為對(duì)照組,然后于600 nm下測(cè)定其OD值,平時(shí)試驗(yàn)三次,并計(jì)算抑制率。

表1 5種防腐劑的質(zhì)量濃度Table 1 Mass concentration of five preservatives

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)上述公式分別計(jì)算各防腐劑不同濃度對(duì)腐敗菌株的抑制率,并將其轉(zhuǎn)化為概率值。利用Excel 2010計(jì)算出各防腐劑的毒力回歸方程、IC50及其RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗細(xì)菌的分離篩選

通過(guò)稀釋涂布及平板劃線(xiàn)培養(yǎng)從脹袋變質(zhì)的腌韭菜根中分離純化出17株單菌落,經(jīng)多次傳代培養(yǎng)篩選,有11株長(zhǎng)勢(shì)良好,其菌落形態(tài)穩(wěn)定。致腐能力測(cè)試發(fā)現(xiàn)編號(hào)為XB1、XB2、XB9、XB10、XB11的菌株使韭菜根腐敗的較快,其中XB1、XB9可使真空包裝腌韭菜根在15 d內(nèi)發(fā)生脹包,XB2、XB10、XB11使韭菜根色澤變暗。

2.2 腐敗細(xì)菌的形態(tài)及生理生化鑒定

表2是5株腐敗細(xì)菌的菌落形態(tài)結(jié)果。由表2可知,篩選出的5株腐敗細(xì)菌的菌落從形狀、大小、顏色、隆起度、表面質(zhì)地及邊緣等方面均存在一定的差別,如XB1菌落大且呈擴(kuò)展形,中間乳白邊緣淺黃透明,粘稠;XB2菌落的特點(diǎn)是灰白色,邊緣缺刻狀;XB9菌落,乳白色粘稠,菌落表面培養(yǎng)初期光滑后期發(fā)生褶皺;XB10菌落,淺黃色,呈凸透鏡狀隆起;XB11菌落的特征最明顯,菌落大且不規(guī)則,扁平,油脂質(zhì)地,表面褶皺邊緣呈波狀。圖1為各株腐敗菌的掃描電鏡結(jié)果,A、B、C、D、E分別表示菌株XB1、XB2、XB9、XB10、XB11。XB1菌體呈棒桿狀,表面光滑、無(wú)鞭毛、無(wú)纖毛、產(chǎn)芽孢;XB2菌體呈短桿狀,表面不光滑、無(wú)鞭毛、有纖毛、產(chǎn)芽孢;XB9菌體呈球桿狀,表面光滑、無(wú)鞭毛、無(wú)纖毛、產(chǎn)芽孢;XB10菌體呈球桿狀,表面光滑、無(wú)鞭毛、無(wú)纖毛、產(chǎn)芽孢;XB11菌體呈桿狀,表面褶皺有凹陷、無(wú)鞭毛、無(wú)纖毛、產(chǎn)芽孢。菌株的菌落及菌體形態(tài)在一定程度上會(huì)受到培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間、傳代次數(shù)等因素的影響,且有些菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)較明顯的球桿變化。各株腐敗菌的部分菌體形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表3和表4。由表3可知,所有腐敗菌株均為革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢桿菌。表4結(jié)果表明,所有腐敗菌株均能水解淀粉;除XB9和XB11外,其他三株菌接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性,表明其能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶;除XB10外,其余菌株硝酸鹽還原陽(yáng)性,表明這些細(xì)菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;XB2、XB10、XB11菌株能液化明膠,表明這些菌株具有較強(qiáng)的水解蛋白質(zhì)的能力;所有菌株都具有一定的糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的能力。由此推測(cè),具有產(chǎn)氣能力的菌株是引起韭菜根產(chǎn)品脹袋的主要腐敗菌,產(chǎn)酸和產(chǎn)吲哚菌株是導(dǎo)致韭菜根異味的主要腐敗菌,產(chǎn)酶菌株會(huì)導(dǎo)致韭菜根軟化,具有水解淀粉和蛋白質(zhì)能力的菌株會(huì)影響韭菜根品質(zhì),降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。根據(jù)已有報(bào)道[7-8,17]結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜上分析,真空包裝腌韭菜根中的5株腐敗細(xì)菌可初步確定為芽孢桿菌屬。

表2 腐敗菌的菌落形態(tài)特征Table 2 Colony morphology characteristics of spoilage bacteria strains

圖1 腐敗菌的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron microscopy of spoilage bacteria strains

表3 腐敗菌的菌體形態(tài)特征Table 3 Morphology characteristics of spoilage bacteria thallus

表4 腐敗細(xì)菌的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria strains

2.3 分子生物學(xué)鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

經(jīng)測(cè)序,5株腐敗細(xì)菌的16S rRNA基因序列大小約為1500 bp,均符合細(xì)菌16S rRNA序列長(zhǎng)度。將各菌株序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì),利用MEGA5.0軟件分析其與芽孢桿菌屬內(nèi)相關(guān)種的同源性,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,發(fā)育樹(shù)中XB1、XB9、XB10的16S rRNA序列與Bacillus中的B.megaterium(GenBank登錄號(hào)為KC477208.1)在同一個(gè)分支上,親緣關(guān)系最近;XB2、XB11的16S rRNA序列與B.toyonensis(GenBank登錄號(hào)為KX458036.1)在同一個(gè)分支上,親緣關(guān)系最近;其序列相似性均大于99%。另外,從圖2可以看出,菌株XB1、XB9、XB10與B.megaterium聚為一簇的可信度為86%,菌株XB2、XB11與B.toyonensis聚為一簇的可信度為100%。綜上,XB1、XB9、XB10可鑒定為B.megaterium;XB2、XB11鑒定為B.toyonensis。不過(guò),同一種屬的XB1、XB9、XB10及XB2、XB11在生理生化及形態(tài)上均有細(xì)微差別,分析原因可能是環(huán)境條件導(dǎo)致了菌種的變異,致使其某些性能的改變,其分類(lèi)學(xué)地位的最終確定仍需利用DNA-DNA分子雜交。

圖2 腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of spoilage bacteria strains

2.4 防腐劑對(duì)腐敗細(xì)菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果

由表5～表9可以看出,不同防腐劑對(duì)5株腐敗菌的抑制效果有明顯差異。苯甲酸鈉的IC50為5.63～10.11 μg/mL,山梨酸鉀的IC50為11.24～31.33 μg/mL,脫氫乙酸鈉的IC50為10.07～18.60 μg/mL,EDTA的IC50為20.68～40.70 μg/mL,焦亞硫酸鈉的IC50為15.74～36.37 μg/mL。一般IC50值越大,表明越安全,其抑制作用就越差。由此可知,苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉對(duì)5株腐敗菌具有普遍較好的抑制效果,其次是山梨酸鉀,而焦亞硫酸鈉、EDTA對(duì)5株腐敗菌整體均表現(xiàn)出較弱的抑制作用。則不同防腐劑對(duì)同一種腐敗菌的抑制效果有明顯差異,同一種防腐劑對(duì)不同種屬腐敗菌的抑菌效果不同且對(duì)同種細(xì)菌的不同菌株的抑菌效果也存在差異,這與相關(guān)研究報(bào)道一致[17]。

表5 不同防腐劑對(duì)XB1菌株的毒力Table 5 Toxicity of different preservatives to XB1 strain

表6 不同防腐劑對(duì)XB2菌株的毒力Table 6 Toxicity of different preservatives to XB2 strain

表7 不同防腐劑對(duì)XB9菌株的毒力Table 7 Toxicity of different preservatives to XB9 strain

表8 不同防腐劑對(duì)XB10菌株的毒力Table 8 Toxicity of different preservatives to XB10 strain

表9 不同防腐劑對(duì)XB11菌株的毒力Table 9 Toxicity of different preservatives to XB11 strain

3 結(jié)論與討論

本研究從脹袋變質(zhì)的腌韭菜根中分離篩選出5株優(yōu)勢(shì)腐敗細(xì)菌,經(jīng)鑒定全為芽孢桿菌屬,初步確定由3株Bacillusmegaterium和2株Bacillustoyonensis組成,其分類(lèi)學(xué)地位的最終確定仍需利用DNA-DNA分子雜交。經(jīng)革蘭氏染色,5株腐敗菌均為陽(yáng)性,其中XB1不產(chǎn)酸產(chǎn)氣,XB9產(chǎn)酸產(chǎn)氣,XB2、XB10、XB11產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。防腐劑抑菌試驗(yàn)表明,不同防腐劑對(duì)同一種腐敗菌的抑制效果有明顯差異,同一種防腐劑對(duì)不同種屬腐敗菌的抑菌效果不同且對(duì)同種細(xì)菌的不同菌株的抑菌效果也存在差異,綜合分析抑菌效果從高到低依次為:苯甲酸鈉>脫氫乙酸鈉>山梨酸鉀>焦亞硫酸鈉>EDTA。

微生物生長(zhǎng)繁殖是導(dǎo)致真空包裝腌韭菜根腐敗脹包的主要原因。本研究分離獲得的腐敗菌種類(lèi)及特征與以往的報(bào)道相符,同時(shí)也存在區(qū)別[7-9]。Bacillusmegaterium為常見(jiàn)食品腐敗菌,而B(niǎo)acillustoyonensis在食品腐敗微生物研究的文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道,但Kantas等[18]報(bào)道該菌種是蠟狀芽孢桿菌的一種自然發(fā)生的非產(chǎn)毒性非致病性菌株,可作為仔豬的飼料添加劑,還能提高綿羊?qū)ε０捳畈《?型疫苗的免疫應(yīng)答[19],張立強(qiáng)等[20]曾從熱帶雨林土壤中分離得到并證明其具有抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)活性。此外,化學(xué)合成防腐劑的安全性一直備受質(zhì)疑,故后期研究可考慮天然、安全、高效的天然防腐劑[11,21]。本研究分離得到的腐敗菌,可作為腌韭菜根的防腐保鮮處理中的目標(biāo)菌,為下一步進(jìn)行腐敗過(guò)程中的感官與品質(zhì)變化、天然防腐劑的篩選與應(yīng)用以及滅菌工藝研究提供有價(jià)值的指導(dǎo)。