林洪斌,方佳興,畢小朋,于筱雨,何 強,劉 平,丁文武,車振明

(1.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039; 2.四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610065)

郫縣豆瓣起源于四川郫縣,歷史悠久,主要原料由二荊條辣椒、蠶豆、小麥粉和鹽組成,色澤紅潤,醬香味濃郁[1-2],是川菜中重要的調(diào)味料,被譽為“川菜之魂”[3]。作為一種極具地方特色的發(fā)酵型調(diào)味品,其特殊的發(fā)酵工藝、原料及環(huán)境因素造就了郫縣豆瓣獨特的風味品質(zhì)[4],同時為探明其風味形成機理帶來了困難。目前國內(nèi)對郫縣豆瓣的風味研究主要集中在香氣成分分析[5-6],而郫縣豆瓣呈味物質(zhì)方面的研究較為缺乏。氨基酸作為郫縣豆瓣中一類重要的呈味物質(zhì),主要來源于蛋白的水解和微生物代謝[7],能夠呈現(xiàn)酸、甜、鮮、咸等多種味道,使郫縣豆瓣鮮味柔和,并增進色澤,調(diào)和香氣,從而成為評價郫縣豆瓣品質(zhì)的重要因素之一[8]。

超聲波提取是利用超聲波的空穴效應及機械效應,破碎原料的細胞壁,從而加速有效成分的溶出和擴散,具有提取時間短、效率高、成本低等優(yōu)點[9]。董曉菲等[10]利用超聲波優(yōu)化太子參總氨基酸提取工藝,得率達到11.20 mg/g,但郫縣豆瓣中氨基酸提取工藝的研究較少,更是鮮有文獻對郫縣豆瓣中氨基酸的呈味特性進行分析,武俊瑞等[11]發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉游離氨基酸具有明顯差異,索化夷等[12]研究表明豆豉氨基酸中鮮味氨基酸占比較大,鮮味突出。

本文采取響應曲面法優(yōu)化郫縣豆瓣呈味游離氨基酸超聲提取工藝,并比較6種郫縣豆瓣中氨基酸含量及對呈味貢獻作用,以期為郫縣豆瓣呈味機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹丹、鵑城、川老匯、川驕、川郫、旺豐牌一級郫縣豆瓣 西華大學西門世紀百盛超市;色氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸 純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司;檸檬酸鋰(四水)、氯化鋰、檸檬酸、氫氧化鋰、氫氧化鈉、硼氫化鈉、無水乙酸鈉、茚三酮、無水乙醇、硫代雙乙醇、聚氧乙烯月桂醚、辛酸、苯甲酸、乙二醇甲醚、冰乙酸 分析純,成都科龍化工廠;氮氣 純度≥99.999%,成都昕源化工有限公司。

KH3200E超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;BSA224S分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;TDZ5-WS離心機 上海盧湘儀器有限公司;DK-99-Ⅱ電子萬用電爐 天津市泰斯特儀器有限公司;MVS-1旋渦混合器 北京金紫光科技發(fā)展有限公司;日立L-8900型全自動氨基酸分析儀 日立高新技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水浸提游離氨基酸的工藝流程 郫縣豆瓣樣品→研磨→加水旋渦震蕩→超聲浸提→離心→待測液

準確稱量各品牌豆瓣2 g置于研缽研磨至粉碎,按照單因素實驗要求以一定液料比加入純水混勻,漩渦震蕩1 min,在一定溫度下,恒定超聲功率300 W超聲浸提一定時間取出,3500 r/min離心20 min,取上清液為待測液。

1.2.2 單因素實驗 參考已有文獻,超聲功率對氨基酸得率影響較小[10],且超聲功率增大至空化效應飽和后,繼續(xù)增加超聲功率只會加強超聲波的散射和衰減,不利于空化[13],綜合考慮,選定超聲功率300 W,并選擇液料比、超聲溫度、超聲時間3個對游離氨基酸提取有較大影響的因素進行單因素實驗[14-15]。

1.2.2.1 液料比對郫縣豆瓣氨基酸提取量的影響 固定超聲功率300 W,超聲溫度35 ℃,超聲時間30 min,考察不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g))對游離氨基酸提取量的影響。

1.2.2.2 超聲溫度對郫縣豆瓣氨基酸提取量的影響 固定超聲功率300 W,液料比20∶1 (mL/g),超聲時間30 min,考察超聲溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)對游離氨基酸提取量的影響。

1.2.2.3 超聲時間對郫縣豆瓣氨基酸提取量的影響 固定超聲功率300 W,液料比20∶1 (mL/g),超聲溫度35 ℃,考察超聲時間(20、25、30、35、40 min)對游離氨基酸提取量的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎上,采用中心組合試驗設計響應面試驗來優(yōu)化游離氨基酸提取工藝。

表1 響應面分析因素水平Table 1 Factors and levels used for response surface analysis

1.2.4 氨基酸提取量的測定 基于茚三酮與氨基酸反應生成藍色物質(zhì)原理,對游離氨基酸提取量進行測定[16]。

稱取干燥至恒重色氨酸標準品加水分別配制成濃度梯度為0.025、0.0375、0.05、0.0625、0.075、0.0875、0.1 mg/mL的溶液,分別取上述溶液1 mL加入pH6.5的CH3COONa緩沖溶液和2%茚三酮溶液各1.0 mL,搖勻,置于沸水浴中加熱40 min,取出并冷卻15 min,以純水溶液為空白對照,于570 nm處測定吸光值A,繪制標準曲線,標準曲線公式如下:

Y=25.126X-0.1772,R2=0.999

式中：Y為吸光度值;X為色氨酸濃度(mg/mL)。

依據(jù)標準曲線,取待測液測定郫縣豆瓣氨基酸質(zhì)量濃度,依據(jù)下述公式計算游離氨基酸提取量:

式中：m為根據(jù)標準曲線算得氨基酸含量(mg/mL);V為待測液體積(mL);W為稱取樣品質(zhì)量(g)。

1.2.5 氨基酸自動分析儀測定游離氨基酸組成 標準溶液的制備:根據(jù)國標GB/T 30987-2014中標準溶液的配制,配制20種游離氨基酸濃度為1.25 μmol/mL作為母液。

流動相的配制:根據(jù)國標GB/T 30987-2014中相關要求配制流動相B1-6及R1-3。

樣品的制備:將待測液于4 ℃下1000 r/min離心15 min,取上層清液過0.22 μm微孔濾膜后,上機測定。

色譜條件:色譜柱日立生理體液分析柱PF(3 μm,1.6 mm×60 mm);反應柱溫度135 ℃;流動相流速為0.35 mL/min,反應液流速為0.30 mL/min;分離梯度條件及反應液梯度條件見GB/T 30987-2014,檢測器檢測波長為570和440 nm。

1.2.6 郫縣豆瓣游離氨基酸呈味分析 滋味物質(zhì)的味道強度值(Taste activity value,TAV)指樣品中滋味物質(zhì)的絕對濃度與該滋味物質(zhì)的呈味閾值之比,通常用來評價單個滋味物質(zhì)對食品滋味的貢獻大小,TAV是一種客觀的評價方式,已廣泛用于食品風味研究[17],本文中計算公式如下:

式中：C為氨基酸自動分析儀測得游離氨基酸濃度,mg/g;T為氨基酸呈味閾值,mg/g。

1.2.7 郫縣豆瓣定量描述滋味感官分析法 采用10點制定量描述滋味感官分析法對郫縣豆瓣感官屬性進行評價。感官評定小組由二十人組成,十五名女性、五名男性,年齡在20～30歲之間,并根據(jù)GB/T-2012-16291.1對二十位感官評定小組成員進行培訓。經(jīng)過預實驗及商量討論后,確定味道參考標準如下:酸(檸檬酸0.03%)、甜(葡萄糖1%)、苦(硫酸奎寧0.9%)、咸(食鹽1%)以及鮮(谷氨酸鈉0.2%)。樣品進行隨機編碼,品嘗杯內(nèi)為0.05 g/mL的樣品水溶液20 mL,每個樣品重復評價3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

采用Design-Expert v 8.0.6軟件進行響應面中心組合試驗設計,采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理統(tǒng)計分析,各項指標結(jié)果以“平均數(shù)(n=5)±標準偏差”表示,采用S-N-K法進行差異顯著性分析(P<0.05),圖表中標注不同字母的數(shù)據(jù)表示數(shù)據(jù)間具有顯著性差異;采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 液料比對游離氨基酸提取量的影響 由圖1可知,游離氨基酸提取量隨液料比的增加,呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,液料比為25∶1 (mL/g)時游離氨基酸提取量達到最大值。一般來說,隨著樣品中溶劑比例升高,提取率也會增加,但當溶劑比例增加到一定比例時,溶劑趨于飽和,此時再增加液料比,不但不會增加游離氨基酸的提取,反而可能使其他水溶性物質(zhì)溶出增加,阻礙游離氨基酸的提取。因此考慮游離氨基酸提取率,選擇20∶1～30∶1 mL/g的液料比作為進一步優(yōu)化的范圍。

圖1 液料比對游離氨基酸提取量的影響Fig.1 Effect of liquid material ratio on extraction of free amino acids

2.1.2 超聲溫度對游離氨基酸提取量的影響 由圖2可知,游離氨基酸提取量隨超聲溫度的增加,呈現(xiàn)先緩慢增加后減少的趨勢。超聲溫度的適當提高可以增加分子擴散速度,有助于提高提取效率,因此在一定范圍內(nèi),提取量會隨超聲提取溫度增加而增加,在30 ℃左右達到最大值;而超過35 ℃后,提取率反而明顯下降。綜上,選擇30～40 ℃的超聲溫度作為進一步優(yōu)化的范圍。

圖2 超聲溫度對氨基酸提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction of free amino acids

2.1.3 超聲時間對游離氨基酸提取量的影響 由圖3可知,隨著超聲時間的延長,游離氨基酸提取量呈現(xiàn)先上升然后趨于穩(wěn)定的趨勢,在25 min左右時達到最大值,說明原料與溶劑充分接觸,傳質(zhì)達到飽和,且氨基酸分子質(zhì)量較小,已大部分溶出,繼續(xù)延長超聲時間,不會對其浸提量有太大影響,反而可能會引起氨基酸分子結(jié)構(gòu)的變化,影響提取率[18]。綜合考慮選擇超聲時間25～35 min作為進一步優(yōu)化的范圍。

圖3 超聲時間對氨基酸提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of free amino acids

2.2 響應面試驗設計與結(jié)果

以液料比、超聲溫度和超聲時間3個實驗因素,根據(jù)單因素實驗結(jié)果選定因素水平,以游離氨基酸提取量為響應值,采用中心組合試驗設計響應面試驗來優(yōu)化游離氨基酸提取工藝,結(jié)果見表2,試驗結(jié)果用Design-Expert進行分析。

2.3 模型的建立、顯著性檢驗及響應面圖分析

對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行多元二次多項式回歸擬合,得到的四元二次回歸方程為:

W=18.31+2.86A-0.19B-0.44C-0.38AB-0.035AC-0.087BC-3.97A2-2.12B2-2.24C2

由表3可知,模型P=0.0007,方程模型達到極顯著,失擬項P=0.0693>0.05不顯著,表明使用該方程預測郫縣豆瓣氨基酸提取工藝是可行的;決定系數(shù)R2=0.9529,說明該模型與實際情況接近,即試驗誤差小,能充分反映出各因素之間的關系,因此,可以用該方程對實驗結(jié)果進行分析。由方差分析可知,因素A、A2、B2、C2影響極顯著(P<0.01),各因素影響程度依次為液料比>超聲時間>超聲溫度,模型中二次項系數(shù)均為負數(shù),表明該模型拋物面開口向下,有極大值點,即游離氨基酸最優(yōu)提取點。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation

經(jīng)Design-Expert軟件對實驗結(jié)果進行分析,做出響應面的3D和等高線分析圖,反映各因素在提取過程中對響應值的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 各因素交互作用對游離氨基酸提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot for the effects of free amino acids extraction

由圖4可知,氨基酸提取率隨液料比、超聲溫度及超聲時間的增大而增大,達到各因素中心值后隨各因素增大而減小。液料比坡面較提取時間和提取溫度坡面更陡,且沿液料比軸向等高線更密集,說明液料比對氨基酸提取量影響顯著,與方差分析結(jié)果一致,所以控制液料比對提高游離氨基酸提取量至關重要。從圖4中也可看出各等高線橢圓形狀不明顯,說明各因素交互作用不明顯。

本實驗經(jīng)優(yōu)化得到最佳的提取條件為液料比為26.82∶1 (mL/g),超聲溫度34.61 ℃,超聲時間29.51 min,預測游離氨基酸提取量為18.86 mg/g,考慮到實際操作的局限性,將提取工藝條件中液料比修改為27∶1 mL/g,超聲溫度35 ℃,超聲時間30 min,在此條件下,重復時間5次,郫縣豆瓣醬中游離氨基酸的提取量為18.51 mg/g,與模型預測性相對誤差為1.86%,證實了該方程的準確性和實用性。

2.4 游離氨基酸定性及定量分析及呈味分析

郫縣豆瓣樣品中氨基酸組成由氨基酸自動分析儀測定。通過與標準色譜圖比較,分別定性和定量測定六種樣品的氨基酸含量,結(jié)果見圖5。同時參考Park等[19]對不同呈味氨基酸的分類方式,將氨基酸分為五類,即甜鮮味、鮮酸味、苦甜味、苦味和咸味氨基酸,見表4?？偣卜治隽藰悠分?9種游離氨基酸,包括17種氨基酸和2種酰胺類物質(zhì),結(jié)果在6種樣品中均未檢測到谷氨酰胺(Gln)和半胱氨酸(Cys),因此將其余17種游離氨基酸作為郫縣豆瓣中的主要呈味氨基酸進行比較和分析。

表4 游離氨基酸呈味分類Table 4 The taste of free amino acids

圖5 氨基酸自動分析儀色譜圖Fig.5 Amino acid automatic analyzer chromatograms

氨基酸不僅能增加發(fā)酵品滋味,也為后續(xù)香氣物質(zhì)形成提供基礎,是風味的重要組成物[20]。

如表5所示,由于發(fā)酵環(huán)境、產(chǎn)品類型、原料來源等不同,6種郫縣豆瓣樣品間游離氨基酸含量均有差異,樣品6中所含游離氨基酸含量最高,但呈味氨基酸組成比例卻大致相同,呈鮮酸味氨基酸含量最高,4種氨基酸的總和分別達到6.460、4.000、6.430、4.940、6.240、10.201 mg/g,總量平均達6.380 mg/g,其中谷氨酸和天冬氨酸含量較高,緊隨其后的是甜鮮味氨基酸,4種氨基酸的總和分別達到5.063、3.902、5.505、4.018、4.891和9.858 mg/g,總量平均值達5.540 mg/g,6種樣品呈鮮味氨基酸總量平均達到11.920 mg/g,這些氨基酸在郫縣豆瓣鮮味形成中起到至關重要的作用。Kim等[21]發(fā)現(xiàn),大醬樣品中大豆蛋白水解而得到的谷氨酸和天冬氨酸可以提供鮮酸味,中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中，谷氨酸是最豐富的氨基酸,其次是天冬氨酸,約占30%左右,此結(jié)論和本實驗結(jié)果相符[22],同時谷氨酸與鹽的復合反應能提高食品鮮味[23],而郫縣豆瓣含鹽量在15%～22%之間,此二者可協(xié)同提高郫縣豆瓣鮮味。除旺豐樣品外,其次含量較高的是苦味和甜味氨基酸。根據(jù)已有研究,蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)在醬制品中提供獨特的甜味[21],黃梅桂等[24]分析甜面醬中眾多呈甜味氨基酸后發(fā)現(xiàn)丙氨酸對甜味起到了重要貢獻。此外,6種樣品中含有少量苦甜味氨基酸成分。

表5 郫縣豆瓣樣品中游離氨基酸含量分析Table 5 Analysis of free amino acids contents in Pixian board bean paste

呈味物質(zhì)對呈味的貢獻與其含量及閾值有密切聯(lián)系,其通常認為,當TAV大于1時,該滋味物質(zhì)對樣品呈味有重要影響,且數(shù)值越大,影響越大,而TAV小于1時,該物質(zhì)對呈味貢獻不大[25]。由表6可以看到,樣品中TAV皆大于1的有丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和纈氨酸,主要包括甜鮮味、鮮酸味及苦甜味氨基酸。鮮味是郫縣豆瓣滋味的一個主要特征,呈鮮味的谷氨酸TAV遠遠高于其他氨基酸,最高的旺豐豆瓣中TAV達到14.82,且谷氨酸和呈味核苷酸間的協(xié)同作用能產(chǎn)生更強烈的鮮味[26],說明谷氨酸是郫縣豆瓣中鮮味的主要貢獻者,其次是纈氨酸和精氨酸TAV較高,其對郫縣豆瓣苦味影響明顯,最后是天冬氨酸、賴氨酸、丙氨酸和組氨酸。其他氨基酸TAV值大多小于1,對滋味貢獻程度較小,但具有不同程度的協(xié)同作用。

表6 郫縣豆瓣中氨基酸TAV分析Table 6 The TAV values of free amino acids in Pixian board bean paste

2.5 滋味感官評價結(jié)果

感官評價人員主要通過酸、甜、苦、咸、鮮五個屬性對6種郫縣豆瓣滋味感官特征進行描述,結(jié)果如圖6所示。由于生產(chǎn)原料、環(huán)境等不同,6種郫縣豆瓣各屬性感官評價得分均有不同,從整體看,6種不同的郫縣豆瓣都呈現(xiàn)較突出的鮮、咸口感,郫縣豆瓣作為一味調(diào)味料,鮮味及咸味是評價其品質(zhì)的重要指標之一。咸味屬性差異主要因為生產(chǎn)過程中添加的鹽含量不同導致,而鮮味主要來源于郫縣豆瓣中的多肽及氨基酸。從圖6中可以看出旺豐豆瓣樣品鮮味最為突出,其鮮味屬性得分最高。結(jié)合氨基酸含量及TAV看,與結(jié)果一致,旺豐豆瓣樣品呈鮮味氨基酸含量及TAV值均遠遠高于其他樣品,尤其是谷氨酸提供了主要的鮮味。而郫縣豆瓣甜味主要由呈甜味氨基酸及部分低聚糖共同影響,但6種郫縣豆瓣甜味屬性得分較低且差別不大,其原因可能呈味還原糖在發(fā)酵過程中的降解和美拉德反應產(chǎn)生了消耗或者較高的鮮味抑制了甜味。同時氨基酸之間相互作用也會影響其他滋味作用的表達,例如甘氨酸在提供鮮甜味的同時也能減少苦味。

圖6 郫縣豆瓣滋味感官評價得分雷達圖Fig.6 The taste sensory quality score radar map of Pixian board bean paste

3 結(jié)論

本研究利用響應面試驗設計優(yōu)化了郫縣豆瓣中游離氨基酸的提取工藝,建立起多元二次優(yōu)化模型。結(jié)果顯示,液料比對游離氨基酸提取量影響最大,結(jié)合實際操作,最終確定游離氨基酸提取工藝條件為液料比27∶1 (mL/g),超聲溫度35 ℃,超聲時間30 min,實際值18.51 mg/g與預測值基本相符,證明該方案的準確可行。

定性及定量分析了6種郫縣豆瓣中游離氨基酸組成,研究發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣中,呈鮮酸味氨基酸總量最多,主要由谷氨酸和天冬氨酸組成,其次是甜鮮味、苦味及甜味氨基酸,其中旺豐豆瓣樣品各類氨基酸含量均明顯高于其他樣品。6種郫縣豆瓣中TAV大于1的氨基酸有丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和纈氨酸,它們對郫縣豆瓣呈味貢獻作用較大,其中谷氨酸對鮮味起重要貢獻作用。結(jié)合滋味感官評價,6種樣品鮮、咸屬性得分較高,而旺豐豆瓣樣品鮮味最突出。本研究結(jié)果為下一步探究郫縣豆瓣關鍵呈味物質(zhì)奠定基礎。同時很多氨基酸也是部分香味物質(zhì)形成的物質(zhì)基礎,要系統(tǒng)闡明氨基酸在郫縣豆瓣中呈香呈味的作用還需進一步研究。