趙梓月 王思遠(yuǎn) 廖森泰 穆利霞 鄒宇曉

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2. 廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610)

目前市場(chǎng)上的補(bǔ)鈣產(chǎn)品大多為碳酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣等離子鈣，這些離子鈣溶解性較差，吸收時(shí)需消耗大量胃酸，吸收率和生物利用率低，在腸道中易形成鈣沉淀[1]。氨基酸及多肽能與鈣離子形成可溶性螯合物，完整地被轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，螯合鈣作為第三代補(bǔ)鈣制劑，具有穩(wěn)定性好、生物利用率高、抗干擾性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，如酪蛋白磷酸肽，是目前為止發(fā)現(xiàn)的最具促鈣吸收作用的短肽，作為鈣強(qiáng)化劑被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品及其他補(bǔ)鈣類功能食品當(dāng)中，此外市場(chǎng)上還有卵黃高磷蛋白磷酸肽螯合鈣和復(fù)方氨基酸螯合鈣等，但產(chǎn)品種類還較單一，價(jià)格較高。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從多種食品蛋白中制備出金屬螯合肽，如大豆[2]、南極磷蝦[3]、太平洋鱈魚(yú)[4]等，并發(fā)現(xiàn)這些肽類在改善鈣等二價(jià)礦物元素生物利用度方面具有極大的潛力，同時(shí)有研究[2]表明肽鈣結(jié)合能力與多肽中羧基含量呈線性相關(guān)，其結(jié)合位點(diǎn)可能是Glu、Asp上的羧基。因此，尋找高效、低成本的多肽材料來(lái)開(kāi)發(fā)多肽螯合鈣制劑具有十分重要的意義。同時(shí)，目前關(guān)于肽鈣結(jié)合機(jī)制的研究主要集中在磷酸基團(tuán)—鈣、羧基—鈣兩種模式[5]，也有研究[6]發(fā)現(xiàn)還有其他多種基團(tuán)在肽鈣反應(yīng)中發(fā)生了變化，但上述研究均未涉及多肽中活性基團(tuán)與鈣結(jié)合的先后順序，還有待進(jìn)一步深入探討。

中國(guó)種桑養(yǎng)蠶歷史悠久，傳統(tǒng)養(yǎng)蠶業(yè)以繭絲為主產(chǎn)品，蠶蛹作為副產(chǎn)物產(chǎn)量很大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年可產(chǎn)鮮繭60余萬(wàn)t，蠶蛹產(chǎn)量可達(dá)40余萬(wàn)t[7]，繅絲后的蠶蛹大多廢棄或加工為飼料，利用率和經(jīng)濟(jì)效益較低。蠶蛹中蛋白質(zhì)含量約為12%～16%，具有良好的氨基酸配比，且Asp和Glu含量最高，分別可達(dá)總氨基酸的10%和14%左右[8]，可提供豐富的肽—鈣結(jié)合位點(diǎn)，是制備肽螯合鈣的優(yōu)質(zhì)原料,但目前尚無(wú)蠶蛹多肽螯合鈣的相關(guān)研究報(bào)道。筆者[9]前期建立了蠶蛹多肽制備工藝，并發(fā)現(xiàn)其具有良好的與鈣結(jié)合能力。試驗(yàn)以蠶蛹為原料制備肽螯合鈣，利用響應(yīng)面優(yōu)化法確定其最佳工藝條件，并跟蹤螯合反應(yīng)中多肽隨鈣源添加的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，探索鈣與多肽的結(jié)合機(jī)理，以期挖掘出一種高含鈣量的多肽螯合鈣原料，為新型高效的補(bǔ)鈣制劑研制和蠶桑資源綜合開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮削絲蠶蛹：兩廣2號(hào)，韶關(guān)翁源縣真誠(chéng)意蠶桑專業(yè)合作社；

Alcalase酶(4.3×106U/mg)、胃蛋白酶(3.0×105U/mg)、胰蛋白酶(4.3×106U/mg)、復(fù)合蛋白酶(2.3×106U/mg)：諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；

石油醚、硫化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鉀、氯化鈣、無(wú)水乙醇、鹽酸：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)：分析純，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；

絡(luò)黑T：分析純，天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

高速冷凍離心機(jī)：CR22G Ⅲ型，廣東廣州日立工機(jī)有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9245A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：ST85Best型，美國(guó)Millrock公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-1800型，日本島津公司；

傅立葉紅外光譜測(cè)定儀：VERTEX 70型，德國(guó)Bruker公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蠶蛹多肽螯合鈣的制備

蠶蛹→漂燙(2 min)→烘干(60 ℃)→粉碎、過(guò)篩(40目)→石油醚脫脂(3倍體積的石油醚浸泡蠶蛹粉，于常溫振蕩4 h，抽濾除去溶劑，重復(fù)3次)→酶解(調(diào)配質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的蠶蛹粉溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的Alcalase酶，55 ℃酶解4 h)→滅酶(沸水浴5 min)→離心(4 000 r/min離心15 min)取上清液→鈣螯合→醇沉(加入4倍體積95%乙醇進(jìn)行沉淀)→離心(4 000 r/min離心15 min)取沉淀→冷凍干燥→蠶蛹多肽螯合鈣

1.2.2 蠶蛹多肽螯合鈣含量、得率及螯合率的測(cè)定

(1) 鈣含量測(cè)定：參照GB/T 5009.92—2016中的EDTA滴定法。

(2) 蠶蛹多肽螯合鈣得率：按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

Y——得率，%；

m1——蠶蛹多肽螯合鈣質(zhì)量，g；

m2——蠶蛹多肽質(zhì)量，g;

m3——氯化鈣質(zhì)量，g。

(3) 蠶蛹多肽螯合鈣螯合率：按式(2)計(jì)算。

(2)

式中：

C——螯合率，%；

m1——螯合態(tài)鈣元素含量，g；

m2——反應(yīng)體系中鈣元素含量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 蛋白酶的影響：選取4種蛋白酶(Alcalase酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胃蛋白酶)對(duì)蠶蛹蛋白進(jìn)行酶解，酶解后的蠶蛹多肽在pH 8、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、肽鈣質(zhì)量比1∶1的條件下進(jìn)行反應(yīng)，以鈣含量為主要指標(biāo)確定出最佳蛋白酶。

(2) pH的影響：選取Alcalase酶酶解蠶蛹蛋白，在反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、肽鈣質(zhì)量比1∶1條件下，分別選取pH 4，6，8，10，12進(jìn)行反應(yīng)，以鈣含量為主要指標(biāo)確定出最佳pH。

(3) 反應(yīng)溫度的影響：選取Alcalase酶酶解蠶蛹蛋白，在pH 10、反應(yīng)時(shí)間60 min、肽鈣質(zhì)量比1∶1條件下，分別選取反應(yīng)溫度30，45，60，75，90 ℃進(jìn)行反應(yīng)，以鈣含量為主要指標(biāo)確定出最佳反應(yīng)溫度。

(4) 反應(yīng)時(shí)間的影響：選取Alcalase酶酶解蠶蛹蛋白，在pH 10、反應(yīng)溫度75 ℃、肽鈣質(zhì)量比1∶1條件下，分別選取反應(yīng)時(shí)間20，40，60，80，100 min進(jìn)行反應(yīng)，以鈣含量為主要指標(biāo)確定出最佳反應(yīng)時(shí)間。

(5) 肽鈣質(zhì)量比的影響：選取Alcalase酶酶解蠶蛹蛋白，在pH 10、反應(yīng)溫度75 ℃、反應(yīng)時(shí)間80 min條件下，分別選取肽鈣質(zhì)量比10∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2進(jìn)行反應(yīng)，以鈣含量為主要指標(biāo)確定出最佳肽鈣質(zhì)量比。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)分析 在單因素試驗(yàn)確定的適宜反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，按照 Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.2.5 蠶蛹多肽螯合鈣紫外光譜分析 配制濃度為 2 mg/mL的蠶蛹多肽和蠶蛹多肽螯合鈣樣品，在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

1.2.6 蠶蛹多肽螯合鈣紅外光譜分析 分別取蠶蛹多肽和肽鈣質(zhì)量比為30∶1，20∶1，10∶1，5∶1的蠶蛹多肽螯合鈣1 mg與100 mg干燥的 KBr 混合、研磨、壓片，在 4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)利用傅里葉紅外光譜儀掃描出紅外光譜圖。

1.2.7 蠶蛹多肽螯合鈣掃描電鏡分析 取一定量蠶蛹多肽短肽、蠶蛹多肽螯合鈣凍干粉樣品抖落至樣盤(pán)雙面膠上，經(jīng)噴金鍍膜處理后放入掃描電鏡抽真空，施加一定電壓后，在1 000倍數(shù)下獲取掃描圖像。電鏡掃描條件設(shè)定為高壓5.00 kV；束流6.9×10-2mA；工作距離8.5 mm。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)應(yīng)用 Design-expert V8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，應(yīng)用Origin 9.0軟件進(jìn)行紫外光譜圖和紅外光譜圖繪制，采用 Excel 軟件繪制圖表，采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，所有試驗(yàn)重復(fù) 3 次及以上，結(jié)果用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 蛋白酶對(duì)蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標(biāo)的影響 利用不同蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白進(jìn)行酶解制備蠶蛹多肽，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Alcalase酶酶解的蠶蛹多肽與鈣結(jié)合后制備出的多肽螯合鈣中鈣含量最高。這可能是由于不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同導(dǎo)致，Adamson等[10]曾研究出Alcalase酶的酶切位點(diǎn)為Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gln羧基側(cè)的肽鍵，使得多肽上的羧基暴露出來(lái)，提供較多的與鈣結(jié)合位點(diǎn)。

2.1.2 pH對(duì)蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標(biāo)的影響 由圖2可得，蠶蛹多肽螯合鈣鈣含量受pH影響較大。當(dāng)pH較低時(shí)，溶液中的H+含量較高，H+與Ca2+爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)-COO-，使多肽螯合鈣的量較少；當(dāng)pH達(dá)到10時(shí)，OH-較多，使得-COOH的H+電離出來(lái)，有利于與鈣離子的結(jié)合；若pH繼續(xù)增大，過(guò)量的OH-會(huì)與Ca2+結(jié)合生成氫氧化鈣沉淀，從而使蠶蛹多肽螯合鈣量下降。因此，在響應(yīng)面設(shè)計(jì)時(shí)，將pH因素的中心試驗(yàn)點(diǎn)選在pH 10。

圖1 蛋白酶對(duì)鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 1 Effect of protease on calcium content, yield and chelation rate

圖2 pH值對(duì)鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 2 Effect of pH on calcium content, yield and chelation rate

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標(biāo)的影響 由圖3可以看出，反應(yīng)溫度從30 ℃升高至90 ℃過(guò)程中，蠶蛹多肽螯合鈣的鈣含量呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，在75 ℃ 達(dá)到最大值。反應(yīng)溫度越高，分子間運(yùn)動(dòng)越劇烈，使得分子間碰撞的幾率增大，有利于發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，當(dāng)碰撞幾率達(dá)到一定程度，蠶蛹多肽與鈣結(jié)合反應(yīng)達(dá)到最大。溫度繼續(xù)升高時(shí)，結(jié)合率反而下降，可能是高溫破壞了多肽分子的結(jié)構(gòu)，其構(gòu)象發(fā)生變化影響了與鈣的結(jié)合。因此，在響應(yīng)面設(shè)計(jì)時(shí)將溫度因素的中心試驗(yàn)點(diǎn)選在75 ℃。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標(biāo)的影響 由圖4可知，從反應(yīng)20 min延長(zhǎng)至反應(yīng)100 min，蠶蛹肽螯合鈣中鈣含量變化較小，但在80 min時(shí)，螯合率和得率均達(dá)到最大值，因此選擇80 min作為蠶蛹肽螯合鈣的反應(yīng)時(shí)間，響應(yīng)面試驗(yàn)中不再研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)蠶蛹多肽與鈣離子結(jié)合反應(yīng)的影響。

圖3 溫度對(duì)鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 3 Effect of temperature on calcium content,yield and chelation rate

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 4 Effect of time on calcium content,yield and chelation rate

2.1.5 肽鈣質(zhì)量比對(duì)蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標(biāo)的影響

由圖5可見(jiàn)，肽鈣質(zhì)量比對(duì)蠶蛹多肽螯合鈣中的鈣含量有較大影響，隨著肽鈣質(zhì)量比的增加，鈣含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在肽鈣質(zhì)量比為4∶1時(shí)鈣含量、得率達(dá)到最大值。若肽鈣質(zhì)量比過(guò)大，則氯化鈣添加不足，結(jié)合反應(yīng)不完全，造成效率較低；若肽鈣質(zhì)量比過(guò)小，則氯化鈣添加過(guò)量，多肽上的鈣結(jié)合位點(diǎn)已飽和，造成鈣浪費(fèi)。因此，在響應(yīng)面設(shè)計(jì)時(shí)將肽鈣質(zhì)量比因素的中心試驗(yàn)點(diǎn)選在4∶1。

圖5 肽鈣質(zhì)量比對(duì)鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 5 Effect of peptide calcium ratio on calcium content, yield and chelation rate

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理對(duì)蠶蛹多肽螯合鈣制備條件進(jìn)一步優(yōu)化，以pH 10、溫度75 ℃、肽鈣質(zhì)量比4∶1為零點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。響應(yīng)面編碼設(shè)計(jì)見(jiàn)表 1。

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定響應(yīng)面試驗(yàn)方案如表2所示。選用 Box-Behnken 模型對(duì)pH、溫度、肽鈣質(zhì)量比3個(gè)因素結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到3個(gè)因素關(guān)于鈣含量的二次多項(xiàng)回歸方程模型為：

R=14.48+0.13A-1.14B-0.80C-1.33AB-1.36AC+1.15BC-3.67A2-3.36B2-2.12C2。

(3)

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Center combination of experimental factors level coding table

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

在設(shè)定的因素水平內(nèi)對(duì)回歸方程進(jìn)行數(shù)學(xué)運(yùn)算，得出的反應(yīng)最佳條件為pH 10.12、溫度72.57 ℃、肽鈣質(zhì)量比為3.41∶1，鈣含量最高理論值為14.740 5%。為方便試驗(yàn)進(jìn)行，調(diào)整反應(yīng)條件為pH 10、溫度73 ℃、肽鈣質(zhì)量比3.4∶1，在此條件下進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到的蠶蛹多肽螯合鈣中平均鈣含量為14.51%，與預(yù)測(cè)值接近。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Responsesurface regression model variance analysis

圖6 響應(yīng)面優(yōu)化圖Figure 6 Response surface optimization map

蠶蛹是蠶繭抽絲后剩下的主要副產(chǎn)物，本研究開(kāi)發(fā)的蠶蛹多肽螯合鈣中鈣含量為14.51%，與已報(bào)道的多種肽螯合鈣如羊骨膠原多肽螯合鈣[11]、大豆肽螯合鈣[12]、豆粕多肽螯合鈣相比[13]，鈣含量顯著提高，具有較高的研究和生產(chǎn)價(jià)值。

2.3 紫外光譜分析

如圖7所示，通過(guò)蠶蛹多肽以及蠶蛹多肽螯合鈣進(jìn)行紫外光譜掃描對(duì)比，發(fā)現(xiàn)蠶蛹多肽與鈣結(jié)合后，在280～300 nm的最大吸收峰值發(fā)生紅移，由288 nm移動(dòng)至290 nm，且吸光度發(fā)生變化，表明有金屬螯合物生成，與多肽螯合物的相關(guān)報(bào)道[14-15]一致。

圖7 紫外光譜圖Figure 7 Ultraviolet spectrum

2.4 紅外光譜分析

蠶蛹多肽分子中含有羧基、羥基、氨基等基團(tuán)，為進(jìn)一步確定參與鈣結(jié)合的基團(tuán)和先后順序，試驗(yàn)研究了不同肽鈣比制備出的蠶蛹多肽螯合鈣的紅外光譜特征，如圖8所示，隨著鈣源的增加，蠶蛹肽螯合鈣紅外結(jié)構(gòu)有顯著差異。蠶蛹多肽與鈣反應(yīng)后，在3 278.55，2 102.46，1 450.55，1 398.83，923.24 cm-15個(gè)吸收峰發(fā)生了明顯的變化。其中3 278.55 cm-1附近為N—H伸縮振動(dòng)特征區(qū)，多肽螯合鈣變?yōu)? 379.73 cm-1，可能是由于NH2與Ca2+配位引起NH拉伸和氫鍵被取代，隨著鈣含量的提高，該峰強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，說(shuō)明氨基在不斷與Ca2+配位。2 102.46 cm-1是亞磷酸基團(tuán)締結(jié)氫鍵形成的吸收峰，此峰在添加鈣量很小的情況下便消失，是由于蠶蛹多肽與鈣結(jié)合后亞磷酸基團(tuán)締結(jié)的氫鍵被Ca2+取代[16]，推測(cè)亞磷酸基團(tuán)優(yōu)先參與肽鈣反應(yīng)。添加Ca2+后，對(duì)應(yīng)于C═O 的波數(shù)從1 655.00 cm-1發(fā)生了藍(lán)移，隨著Ca2+的增加，當(dāng)肽鈣質(zhì)量比達(dá)到5∶1時(shí)，在這附近生成一個(gè)新的吸收峰即1 598.80 cm-1處，主要是由于鈣含量增大使得羧酸與鈣反應(yīng)生成羧酸鹽。在1 398.83 cm-1處觀察到的吸收峰發(fā)生了紅移，歸因于—COO—羧酸酯基團(tuán)的延伸與Ca2+結(jié)合形成COOCa[17]。羧基中—OH的面內(nèi)振動(dòng)吸收峰1 450.55 cm-1及面外振動(dòng)吸收峰923.24 cm-1與鈣結(jié)合后消失，說(shuō)明羧基中—OH參與肽鈣結(jié)合[18]。因此，氨基、羧基、磷酸基團(tuán)參與了蠶蛹多肽與鈣的結(jié)合，其結(jié)合模式推測(cè)如圖9所示。

圖8 不同肽鈣比制備的蠶蛹多肽螯合鈣紅外光譜圖

Figure 8 Infrared spectrum of chelated calcium of silkworm pupapolypeptide prepared by different peptide to calcium ratio

圖9 肽鈣結(jié)合模式Figure 9 Peptide calcium binding mode

2.5 掃描電鏡分析

由圖10可看出，蠶蛹多肽表面光滑，結(jié)構(gòu)緊實(shí)；反應(yīng)后，蠶蛹多肽螯合鈣表面變?yōu)槭杷啥嗫捉Y(jié)構(gòu)，有利于溶解吸收。

圖10 蠶蛹多肽與蠶蛹多肽螯合鈣掃描電鏡圖片

Figure 10 Silkworm pupa protein peptides and silkworm pupa protein peptides binding calcium SEM pictures

3 結(jié)論

以蠶蛹為原料制備了蠶蛹多肽螯合鈣，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法確定了制備的最優(yōu)條件為pH 10、反應(yīng)溫度73 ℃、肽鈣質(zhì)量比3.4∶1、反應(yīng)時(shí)間80 min，在此條件下，得到的蠶蛹肽螯合鈣中鈣含量可達(dá)到14.51%，具有較高的研究和生產(chǎn)價(jià)值。通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡分析可知，蠶蛹多肽與鈣結(jié)合后結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，多肽中氨基、羧基、磷酸基團(tuán)參與肽鈣結(jié)合反應(yīng)。同時(shí)探究了多肽隨鈣源添加的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)磷酸基團(tuán)極易參與肽鈣螯合反應(yīng)。雖然蠶蛹本身具有產(chǎn)量大、氨基酸配比良好等優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)出的蠶蛹多肽螯合鈣鈣含量高，成本較低，但其生物利用率及安全性還有待通過(guò)細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步研究。