秦 珩 李世芬 胡 奇 環(huán) 飛

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 211166；2. 江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心，江蘇 南京 211166)

鹿茸為梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化而帶茸毛的幼角，為傳統(tǒng)中藥材，富含多肽、脂肪酸、氨基酸、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中氨基酸成分占總成分的50%以上[1]。研究者[2]在鹿茸中發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，諸如胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、鹿茸多肽等。其中鹿茸多肽可明顯加速骨組織的再生以及創(chuàng)面的愈合[3]，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)[4]，改善認(rèn)知功能障礙[5]。鹿茸不同部位的水提液對(duì)細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，并且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴效應(yīng)[6]。鹿茸血為采割馬鹿或梅花鹿茸后用真空泵或者分離機(jī)從鹿茸中提取出來(lái)的血液，其營(yíng)養(yǎng)成分較多，尤其是鉀、鈣、鎂、鐵、鋅含量較高，其中鈣、鐵、鋅含量明顯高于鹿茸中的含量[7]，因此鹿茸血的營(yíng)養(yǎng)要高于鹿茸。鹿茸血中營(yíng)養(yǎng)成分高主要是由于血液是供給機(jī)體營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)送源，血液含有22種無(wú)機(jī)元素，18種氨基酸[8]，因此鹿茸血同樣含有多樣營(yíng)養(yǎng)元素[9]，且具有緩解骨質(zhì)疏松[10]，減輕免疫耐受性，限制移植瘤增長(zhǎng)速度的功效[11]。但關(guān)于鹿茸血安全性的評(píng)價(jià)未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)擬通過(guò)小鼠急性毒性試驗(yàn)、30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)、小鼠三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)等對(duì)梅花鹿茸血凍干粉的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[12]的規(guī)定對(duì)梅花鹿茸血緩解小鼠體力疲勞功能進(jìn)行研究，以期為鹿茸血的安全性及緩解體力疲勞作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試樣品

梅花鹿茸血凍干粉：南京中科藥業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑

鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102：Molecular Toxicology, Inc.；

S-9(大鼠肝勻漿S-9)：江蘇齊氏生物科技有限公司；

血漿尿素測(cè)定試劑盒、肝糖原測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

急性毒性試驗(yàn)選用的小鼠：生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2016-0002，合格證編號(hào)201603830，南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；

30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)與緩解體力疲勞試驗(yàn)選用SPF級(jí)健康離乳SD大鼠及SPF級(jí)CI/F1代健康雄性小鼠：生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0016，合格證編號(hào)2008001662204、2008001664130，上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

小鼠微核試驗(yàn)及精子畸形試驗(yàn)的小鼠：生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2012-0004，合格證編號(hào)201605533、201604137，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.1.4 儀器與設(shè)備

電子天平：T-1000型，常熟市雙杰測(cè)試廠；

電熱培養(yǎng)箱：DNP-9162BS型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：Spectra Max M2e型，美國(guó)Molecular Devices公司；

全自動(dòng)生化分析儀：7100型，日立高新技術(shù)(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司；

血液分析儀：ADVIA 2120i型，德國(guó)Siemens公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)(最大耐受量法) 20只SPF級(jí)ICR健康成年小鼠，雌雄各半，體重為18.9～21.8 g。給樣前禁食16 h。直接用無(wú)菌水配制梅花鹿茸血凍干粉，最大可配制濃度為0.375 g/mL，按最大灌胃量20 mL/(kg·BW)分兩次給樣，每次間隔4 h，劑量為15.000 g/(kg·BW)。給樣后觀察并記錄是否有中毒表現(xiàn)及死亡情況，連續(xù)14 d。

1.2.2 Ames試驗(yàn) 在有代謝活化和無(wú)代謝活化條件下采用平板摻入法。選取經(jīng)鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100 和 TA102。β-萘黃酮和苯巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠肝S-9作為活化系統(tǒng)，其蛋白含量為30 mg/mL。設(shè)自發(fā)回變組(陰性對(duì)照)，溶劑對(duì)照組(溶劑為二甲亞砜，0.1 mL/皿)，陽(yáng)性對(duì)照組：不加S-9的活化系統(tǒng)中所用的陽(yáng)性物為2,4,7-三硝基芴銅0.2 μg/皿(TA97、TA98)和甲基磺酸甲酯1.0 μL/皿(TA100、TA102)，加S-9的活化系統(tǒng)中所用的陽(yáng)性物為2-氨基芴10 μg/皿(TA97、TA98、TA100)和1,8-二羥基蒽醌50 μg/皿(TA102)。梅花鹿茸血凍干粉5 000，1 000，200，40，8 μg/皿劑量進(jìn)行試驗(yàn)，分別在加與不加S-9的情況下每個(gè)劑量組做3個(gè)平行。如果受試樣品組的回變菌落數(shù)達(dá)到陰性對(duì)照組回變菌落數(shù)2倍及以上，并有劑量—反應(yīng)關(guān)系則該試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

1.2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 梅花鹿茸血凍干粉試驗(yàn)組為1 875，3 750，7 500 mg/(kg·BW) 3個(gè)劑量，陰性對(duì)照組以無(wú)菌水代替，以20 mL/(kg·BW)進(jìn)行灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺[40 mg/(kg·BW)]。采用30 h 進(jìn)樣法，兩次進(jìn)樣間隔24 h。第2次給樣6 h后，處死動(dòng)物制片。顯微鏡下計(jì)數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算微核率。每只大鼠計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞時(shí)所觀察到的成熟紅細(xì)胞數(shù)(NCE)，并計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比例(PCE/NCE)。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 梅花鹿茸血凍干粉試驗(yàn)組為1 875，3 750，7 500 mg/(kg·BW) 3個(gè)劑量，陰性對(duì)照組以無(wú)菌水代替，以20 mL/(kg·BW)進(jìn)行灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺[40 mg/(kg·BW)]。每天給樣1次，連續(xù)進(jìn)行5 d。動(dòng)物在第一次給樣后的第35天被處死，取兩側(cè)附睪的精子濾液進(jìn)行制片。顯微鏡下計(jì)數(shù)1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，記錄其中精子畸形的類型和數(shù)量，計(jì)算精子畸形率。

1.2.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn) 將80只SPF級(jí)健康斷奶SD大鼠按體重隨機(jī)分為4組，雌雄各半。通過(guò)逐步稀釋樣品的方法將梅花鹿茸血凍干粉摻入基礎(chǔ)飼料中，按體重的10%折算。梅花鹿茸血凍干粉以0.6，1.3，2.0 g/(kg·BW·d)3個(gè)劑量摻入基礎(chǔ)飼料的百分含量分別為0.6%，1.3%，2.0%，連續(xù)喂養(yǎng)30 d后采集血樣進(jìn)行常規(guī)血液檢查、生化檢查，同時(shí)進(jìn)行大體解剖和組織病理學(xué)檢查。

1.2.6 緩解體力疲勞作用 選用SPF級(jí)CI/F1代健康雄性小鼠160只，按體重隨機(jī)分為4個(gè)組，每組40只，以梅花鹿茸血凍干粉0.1，0.2，0.6 g/(kg·BW·d)的劑量，小鼠每天灌胃1次，陰性對(duì)照組給予相同體積的溶劑，灌胃量為0.1 mL/(10 g·BW)，持續(xù)30 d。

(1) 第1組小鼠在最后一次給樣30 min后，每只小鼠尾根部負(fù)重5%體重的鉛絲，置于游泳箱中游泳。以小鼠游泳開(kāi)始至死亡時(shí)間作為負(fù)重游泳時(shí)間。

(2) 第2組小鼠在最后一次給樣30 min后，置于游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，休息60 min后立即眼眶采血。血液離心后，吸取20 μL血漿，用二乙?！糠y(cè)定血漿尿素值。

(3) 第3組小鼠在最后一次給樣30 min后，立即處死，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟配制成1%肝勻漿液，取1%肝勻漿液0.1 mL，加2 mL蒽酮試劑，煮沸5 min，冷卻后在620 nm波長(zhǎng)比色測(cè)定，根據(jù)所稱取的肝臟重量計(jì)算肝糖原含量。

(4) 第4組小鼠在最后一次給樣30 min后眼眶采血。然后于游泳箱中不負(fù)重游泳10 min后撈起，再次眼眶采血，休息20 min后第3次采血，用血乳酸分析儀測(cè)定各時(shí)點(diǎn)血乳酸含量，并計(jì)算血乳酸曲線下面積。

血乳酸曲線下面積按式(1)計(jì)算。

S=1/2×[(OD1+OD2)×10+(OD2+OD3)×20]，

(1)

式中：

S——血乳酸曲線下面積；

OD1——游泳前血乳酸值，mmol/L；

OD2——游泳10 min后的血乳酸值，mmol/L；

OD3——休息20 min后的血乳酸值，mmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)各組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)滿足均勻方差要求的數(shù)據(jù)用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用秩和檢驗(yàn)法處理方差不齊的數(shù)據(jù)資料，P<0.05為差異顯著。用泊松分布U檢驗(yàn)法對(duì)骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用秩和檢驗(yàn)法對(duì)小鼠精子畸形結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

由表1可見(jiàn)，在觀察期內(nèi)未見(jiàn)有動(dòng)物死亡，且梅花鹿茸血凍干粉對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。梅花鹿茸血凍干粉小鼠急性經(jīng)口毒性劑量>15 g/(kg·BW)，樣品為無(wú)毒級(jí)。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中關(guān)于急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，梅花鹿茸血凍干粉屬于無(wú)毒級(jí)。

表1 小鼠急性經(jīng)口毒性Table 1 Acute oral toxicity in mice (n=10)

2.2 Ames試驗(yàn)

由表2可見(jiàn)，梅花鹿茸血凍干粉各劑量組回變菌落數(shù)均不超過(guò)陰性對(duì)照組的2倍，且不存在明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。因此認(rèn)為在加與不加S-9時(shí)梅花鹿茸血凍干粉對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗(yàn)菌株無(wú)致基因突變作用。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

由表3可見(jiàn)，梅花鹿茸血凍干粉各劑量組微核率與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但陽(yáng)性對(duì)照組微核率顯著高于陰性對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。梅花鹿茸血凍干粉各劑量組PCE/NCE比值小于陰性對(duì)照組的20%，對(duì)骨髓細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表4、5可見(jiàn)，梅花鹿茸血凍干粉不同劑量組精子畸形率與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組精子畸形率明顯高于陰性對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此梅花鹿茸血凍干粉的小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.5 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

由表6～8可見(jiàn)，梅花鹿茸血凍干粉在連續(xù)喂飼大鼠30 d后，對(duì)雌、雄性大鼠各觀察點(diǎn)的體重?zé)o明顯影響，對(duì)各劑量組大鼠的的血液及生化指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯影響。梅花鹿茸血凍干粉高劑量組和陰性對(duì)照組大鼠的肝、腎、脾、胃、十二指腸、卵巢、睪丸進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查，如圖1所示，高劑量組的大鼠臟器未見(jiàn)有明顯的組織病理學(xué)改變。

2.6 小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、運(yùn)動(dòng)后血清尿素水平、肝糖原儲(chǔ)備量及血乳酸曲線下面積

小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的長(zhǎng)短能反映小鼠的耐力情況[13]，由表9可見(jiàn)，梅花鹿茸血凍干粉0.60 g/(kg·BW·d)組的小鼠負(fù)重游泳時(shí)間明顯長(zhǎng)于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明梅花鹿茸血凍干粉具有增進(jìn)體能，增強(qiáng)耐力的作用。各劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后的血清尿素水平與陰性對(duì)照組比較，無(wú)明顯差異。梅花鹿茸血凍干粉0.10，0.20，0.60 g/(kg·BW·d)劑量的肝糖原儲(chǔ)備量高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝糖原是由許多葡萄糖分子聚合而成的物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，便可分解成葡萄糖，轉(zhuǎn)化為能量[14]。研究結(jié)果表明鹿茸血可增加肝糖原的儲(chǔ)備量，為機(jī)體提供更多的能量，減少劇烈體力運(yùn)動(dòng)后糖原的消耗，起到緩解體力疲勞的作用。血液中的乳酸濃度在強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)急劇上升，體內(nèi)的乳酸來(lái)不及處理，造成乳酸的堆積[15]，鹿茸血凍干粉0.60 g/(kg·BW·d)組的小鼠游泳前后血乳酸曲線下面積值小于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明梅花鹿茸血凍干粉能增加有氧代謝能力，促進(jìn)乳酸代謝，降低血液中乳酸濃度，使乳酸能更快速地轉(zhuǎn)化為肌肉收縮所需的能量，緩解運(yùn)動(dòng)后疲勞感，與白晨等[16]的研究結(jié)果一致。

表2 Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)? Table 2 Ames test retrograde colony count (n=3)

? **超過(guò)陰性對(duì)照組菌落數(shù)2倍以上。

表3小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率和嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值?

Table3Incidenceofmicronucleusinbonemarrowcellsandratioofpolychromaticerythrocytetomatureerythrocyteinmice(PCE/NCE) (n=5)

性別劑量/(mg·kg-1·BW)PCE數(shù)含微核的PCE數(shù)微核率/‰PCE/NCE雌陰性對(duì)照5 00061.2±0.81.06±0.061 8755 00091.8±0.81.05±0.073 7505 00061.2±0.81.09±0.057 5005 00081.6±1.31.08±0.03陽(yáng)性對(duì)照5 00010320.6±2.4??0.91±0.05雄陰性對(duì)照5 00010 2.0±1.21.08±0.051 8755 00081.6±1.11.04±0.053 7505 00071.4±0.51.05±0.087 5005 00071.4±1.11.08±0.05陽(yáng)性對(duì)照5 00011422.8±4.1??0.92±0.05

? **與陰性對(duì)照組比較(P<0.01)。

表4 小鼠精子畸形率?Table 4 Rate of sperm abnormality in mice (n=5)

? **與陰性對(duì)照組比較，P<0.01。

表5 小鼠精子畸形類型及比例?Table 5 Types and proportions of sperm abnormalities in mice

? 占比為該類畸形數(shù)量占總畸形數(shù)量的百分比。

表6 大鼠體重Table 6 Weight of rats (n=10)

表7 大鼠血液學(xué)指標(biāo)Table 7 Hematological indices in rats (n=10)

圖1 組織病理學(xué)圖片F(xiàn)igure 1 Histopathological picture

性別劑量/(g·kg-1·BW)谷丙轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1)谷草轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1)總蛋白/(g·L-1)白蛋白/(g·L-1)尿素氮/(mmol·L-1)肌酐/(μmol·L-1)總膽固醇/(mmol·L-1)甘油三酯/(mmol·L-1)血糖/(mmol·L-1)雌0.033±6130±3055.3±1.637.7±0.87.72±1.3637±42.19±0.370.47±0.115.82±1.190.633±4125±1457.1±2.438.6±1.27.80±1.4637±72.11±0.160.43±0.065.61±0.361.337±12142±2156.0±1.837.9±1.28.62±1.7243±82.09±0.310.50±0.166.08±0.652.036±4141±1155.9±2.137.6±0.79.42±2.1637±42.05±0.300.44±0.116.20±0.49雄0.041±7149±2854.5±1.236.5±0.76.07±0.9931±61.46±0.300.66±0.196.14±1.300.645±5149±2154.7±1.336.6±0.85.94±0.8728±31.57±0.280.84±0.256.64±0.831.347±8150±2854.3±0.936.5±0.55.82±0.5030±31.49±0.250.75±0.096.36±1.132.042±8156±2553.8±1.936.3±1.05.94±0.5330±31.44±0.350.79±0.176.73±1.30

表9小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、血漿尿素水平、肝糖原儲(chǔ)備量、血乳酸曲線下面積?

Table9Weight-bearingswimmingtime,plasmaurealevel,hepaticglycogenreserveandareaunderbloodlacticacidcurveinmice(n=10)

劑量/(g/kg-1·BW·d-1)負(fù)重游泳時(shí)間/s血漿尿素/(mmol·L-1)肝糖原/(mg·g-1·Liver)血乳酸曲線下面積值0.00448±1557.98±0.6210.3±6.297±140.10587±1778.33±0.5422.5±2.4??86±220.20591±1408.26±0.4321.1±5.4??83±120.60661±163?7.47±0.5417.4±5.8?78±10?

? *與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；**與陰性對(duì)照組比較，P<0.01。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，梅花鹿茸血凍干粉食用安全性，且具有緩解小鼠體力疲勞功能。推測(cè)是因?yàn)槁谷籽凶鳛檠旱鞍讈?lái)源的活性肽具有多種生理活性[17]，尤其是含有的睪酮具有維持肌肉強(qiáng)度及質(zhì)量、提升體能等作用[18]。試驗(yàn)僅從動(dòng)物試驗(yàn)的角度證實(shí)了鹿茸血凍干粉的安全性及緩解體力疲勞的作用，鑒于動(dòng)物與人類之間的差異，對(duì)于人類食用來(lái)說(shuō)是否安全及是否有明確的緩解體力疲勞作用還需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。