王利利, 趙文廣, 丁壯, 王正平, 趙燕娜, 韓軍,3,*

卡培他濱對非靶標生物斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性研究

王利利1, 趙文廣2, 丁壯1, 王正平1, 趙燕娜1, 韓軍1,3,*

1. 聊城大學, 生物制藥研究院, 山東, 聊城 252000 2. 聊城市傳染病醫(yī)院, 山東, 聊城 252000 3. 聊城高新生物技術(shù)有限公司, 山東, 聊城 252000

為評價抗腫瘤藥物卡培他濱(CAP)對非靶標生物的毒性, 以斑馬魚胚胎為受試生物, 研究了CAP對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性及對其抗氧化酶系的影響。結(jié)果表明, 直接暴露于卡培他濱中, 造成斑馬魚胚胎死亡率和畸形率增加, 且其機能有所下降。當暴露濃度高于20 μg·L-1時, 處理后的斑馬魚胚胎死亡率和畸形率顯著升高, 與對照組相比有極顯著差異。CAP濃度為0.2 μg·L-1時, 超氧化物歧化酶 (SOD) 活性和過氧化氫酶 (CAT) 活性均顯著升高, 表明機體遭受一定程度的氧化損傷; 當濃度高于20 μg·L-1時, SOD和CAT活性顯著降低, 表明斑馬魚仔魚所受氧化損傷超出其自我修復(fù)能力, 引發(fā)致死性傷害。本文從發(fā)育毒性及氧化應(yīng)激著手, 探究了CAP對非靶標生物的潛在危害, 為其生態(tài)效應(yīng)提供一定的科學依據(jù)。

卡培他濱; 非靶標生物; 斑馬魚胚胎; 發(fā)育毒性; 氧化損傷

0 前言

卡培他濱 (Capecitabine, 簡稱CAP, 分子式為C15H22O6N3F), 化學名為N4-戊基羧酸-5’-脫氧-5-氟胞嘧啶, 是抗代謝氟嘧啶脫氧核苷氨基甲酸酯類抗腫瘤藥[1], 能夠抑制細胞分裂和干擾RNA和蛋白質(zhì)的合成, 主要用于晚期原發(fā)性或轉(zhuǎn)移型乳腺癌、直腸癌、結(jié)腸癌等癌癥的治療[2]。作為一種腫瘤內(nèi)激活的前體藥物, CAP具有較高的腫瘤選擇性, 特異性較強, 目前CAP的使用量也在不斷增加[3]。近年來, CAP的消耗量約每年75—90 kg[4], 隨著藥物的濫用, 藥源污染物在環(huán)境中的污染程度日益增加并受到了廣泛的關(guān)注[5]。據(jù)調(diào)研, 中型醫(yī)院的醫(yī)院廢水中檢測到CAP濃度高達1749 ng·L-1[6], CAP在12個西班牙污水處理廠中的檢出濃度范圍為nd(未檢出)—72.6 ng·L-1[7]。隨著CAP在水體中不斷被檢測出, 其釋放入環(huán)境后所產(chǎn)生的環(huán)境效應(yīng)的評價越來越受到關(guān)注[5–6]。目前對CAP的水生毒性研究主要集中與浮游動物, 如輪蟲、大型溞等[8–9], 但對魚類等高等水生生物的毒性風險還相對空白, 本文擬采用模式生物斑馬魚對CAP的水生生物毒性進行研究。

斑馬魚(Brachydanio rerio)作為模式生物已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、免疫學以及腫瘤造模等的研究[10–11]。斑馬魚基因與人類基因同源性高達87%, 其模型數(shù)據(jù)大多數(shù)情況下適用于人體[12]。另外, 斑馬魚的卵具有透明性, 整個胚胎發(fā)育在體外完成, 因此不僅可以很容易獲得完整胚胎, 還可以在顯微鏡下直接觀察其發(fā)育的整個過程[13], 在人類疾病、藥物效應(yīng)及水生毒性評價等方面具有良好的研究意義[13–15]。同時, 斑馬魚胚胎毒性技術(shù)是各國標準組織認可的測定單一化學品毒性的方法之一, 本研究擬采用斑馬魚胚胎毒性技術(shù)對CAP的生物毒性進行系統(tǒng)性評價, 以便探討CAP的毒性效應(yīng), 為其安全性評價提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

試劑: 卡培他濱原料藥 (CAP, 98%), 購自武漢宏信精細化工有限公司; 氯化鉀 (Potassium chloride, KCl, 南京化學試劑有限公司); 蛋白質(zhì)測試試劑盒(BCA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)均購自南京建成生物工程研究所; 其他試劑均為分析純。

儀器: 電熱恒溫培養(yǎng)箱 (MGC-300A, 上海一恒); 紫外-可見分光光度計 (752, 上海菁華科技儀器有限公司); 冷凍離心機 (SIGMA2-16K, 希格瑪SIGMA); 分析天平 (AUY220, SHIMADZU) 顯微鏡 (BK5000, 重慶奧特)。

1.2 受試生物

實驗用斑馬魚為野生型AB品系, 成魚購自江蘇軒佳斑馬魚公司, 參考文獻[16]進行斑馬魚的實驗室馴養(yǎng), 雌雄分開飼養(yǎng), 平均體長為(3.60±0.30) cm, 選擇行動靈敏, 逆水性強, 外觀正常的健康個體進行實驗室馴養(yǎng), 實驗室養(yǎng)殖用水為曝氣48 h的自來水, 平均1 g魚于1 L水中, 每天喂食2次, 產(chǎn)卵前實驗室馴養(yǎng)14 d。實驗室馴養(yǎng)期間, 自然死亡率不得高于1%, 將產(chǎn)卵期斑馬魚按雌雄比例2: 2放置于孵化器中待產(chǎn), 于第二天抽去隔板開始交配產(chǎn)卵, 產(chǎn)卵時長為1 h, 收集并清洗胚胎, 置于光照培養(yǎng)箱中, 溫度為(28±1) ℃, 光/暗周期為14 h: 10 h。于6 h后置于顯微鏡下觀察, 去除死亡胚胎, 選取正常分裂的受精卵分組暴露于不同濃度的CAP溶液中。

1.3 暴露實驗

于顯微鏡下觀察, 挑選發(fā)育正常、大小相近的受精卵即胚胎進行暴露實驗, 將胚胎于受精后6 h暴露于CAP溶液中, 其濃度分別為0 μg·L-1()、0.2 μg·L-1、20 μg·L-1和2000 μg·L-1。于24孔細胞板中每孔加入2 mL相應(yīng)濃度的CAP溶液, 放入1枚胚胎, 每板放置20顆胚胎作為一個平行, 每個濃度設(shè)置3個平行。采用半靜態(tài)換液, 即暴露溶液每24 h更換一半。暴露期間水溫保持(28±1) ℃, 光/暗周期為14 h: 10 h。

以每孔放置1個胚胎樣本, 胚胎發(fā)育毒性一般為24—144 h, 觀察時期包括胚胎期和自由胚期。致死性毒理性終點()[17]: 卵凝滯、尾部無伸展、無心跳等; 亞致死毒理性終點(): 孵化延遲、心跳減緩或停止、自主運動次數(shù)減少等; 致畸性毒理性終點(): 脊柱彎曲、尾部畸形心包水腫等。分別于受精后觀測胚胎孵化情況和144 h后仔魚畸形率; 并于受精后24 h觀察記錄胚胎20 s內(nèi)的自主運動, 于受精后72 h觀測20 s內(nèi)的心跳。

1.4 抗氧化指標測定

胚胎暴露144 h后, 用28 ℃雙蒸水清洗受試斑馬魚仔魚, 去除表面CAP干擾, 將仔魚置于潔凈勻漿管中, 參照文獻制備仔魚的組織勻漿[18]: 去除水分稱重, 按1: 9 (g:mL) 加入預(yù)冷生理鹽水, 在冰水浴中進行勻漿, 采用14000 r·min-1, 4 ℃離心勻漿液10 min, 取上清置于-80 ℃條件下保持備用, 蛋白含量及SOD、CAT的測定按試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析, 運用單因素方差分析法 (one-way ANOVA)。*< 0.05表示實驗組與對照組存在顯著性差異; **< 0.01表示實驗組與對照組存在極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎孵化率及胚胎機體性能

CAP暴露對斑馬魚胚胎的孵化率的影響見圖1, 由圖可知, 0.2 μg·L-1CAP暴露條件下, 對斑馬魚胚胎的孵化沒有明顯的影響, 隨著CAP濃度的升高, 其孵化率顯著下降 (< 0.01)。高濃度的CAP暴露對斑馬魚胚胎48 h和56 h的孵化率影響顯著, 72 h時, 除去死亡胚胎, 存活的胚胎孵化率在各暴露條件下均無明顯差異。表明20 μg·L-1和2000 μg·L-1CAP暴露致使斑馬魚胚胎的孵化時長延長, 至72 h后無明顯差異。

以暴露后24 h的胚胎自主運動和暴露后72 h的胚胎心跳次數(shù)為指標, 對斑馬魚胚胎的機體性能進行考察 (見圖2), 胚胎的自主運動與其孵化率有直接的關(guān)系, 自主運動較高時, 其孵化較快。從圖中可知, 隨著暴露CAP的濃度增加, 斑馬魚胚胎的自主運動有下降的趨勢。低濃度下 (0.2 μg·L-1和20 μg·L-1), 自主運動雖有下降趨勢, 但與對照組無明顯差異 (> 0.05)。當暴露CAP濃度達2000 μg·L-1時, 表現(xiàn)出明顯的抑制效果 (< 0.05), 這與孵化率的結(jié)果也存在一致性。另外, 從暴露后72 h的胚胎心跳次數(shù)也可以發(fā)現(xiàn), 隨著暴露CAP的濃度增高, 心跳次數(shù)逐漸降低, 當濃度達到2000 μg·L-1時, 與對照組相比, 心跳次數(shù)明顯減慢 (< 0.05)。從上述結(jié)果可知, CAP對斑馬魚胚胎具有明顯的損傷作用, 隨著濃度的升高, 其損傷增強, 具有明顯的濃度依賴性。

圖1 CAP暴露對斑馬魚胚胎孵化率的影響

Figure 1 Hatching rate of zebrafish embryos upon exposure to different concentrations of CAP. (*< 0.05, **< 0.01)

圖 2 CAP暴露24 h后斑馬魚胚胎自主運動 (A)及72 h對斑馬魚胚胎心跳次數(shù) (B)

Figure 2 Spontaneous movement (A) and heart beats (B) of zebrafish embryos upon exposure to different concentrations of CAP, at 24 h and 72 h, respectively. (*< 0.05, **< 0.01)

2.2 仔魚的死亡率以及畸形率

CAP暴露144 h后斑馬魚仔魚的死亡率和畸形率見圖3。由圖可知, 與對照組相比, 當CAP的暴露濃度為0.2 μg·L-1時, 仔魚的死亡率和畸形率均無明顯變化 (> 0.05), 但當濃度升高到20 μg·L-1和2000 μg·L-1時, 其死亡率和畸形率均顯著升高 (< 0.01), 且隨暴露濃度增高, 死亡率和畸形率均呈增長趨勢。主要的形態(tài)異常見圖4, 當濃度升高時, 部分卵發(fā)育過程中出現(xiàn)了胎盤細胞破損甚至卵黃凝結(jié), 影響胚胎的存活及孵化, 隨著發(fā)育時間的延長, 斑馬魚幼體出現(xiàn)了腹部水腫、心胞囊腫以及脊柱彎曲等現(xiàn)象。

2.3 抗氧化應(yīng)激效應(yīng)

由圖5可見, 不同暴露濃度的CAP處理144 h后, CAP暴露濃度為0.2 μg·L-1時, 仔魚體內(nèi)SOD和CAT活性均較空白組有明顯升高(< 0.05), 而高于0.2 μg·L-1時, CAP暴露組斑馬魚胚胎SOD活力和CAT活力均有顯著降低 (< 0.01)。從SOD活力變化可知, CAP處理144 h后, SOD活性隨著CAP濃度的增大而呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢, 各暴露組間存在明顯的差異 (< 0.05)。對于CAT活性變化, 20 μg·L-1和2000 μg·L-1濃度組與0.2 μg·L-1濃度組具有極顯著差異 (< 0.01), 而20 μg·L-1濃度組與2000 μg·L-1濃度組間并無顯著性差異 (> 0.05)。

圖 3 CAP暴露144 h對斑馬魚仔魚的死亡率和畸形率的影響

Figure 3 Mortality and deformation rate of zebrafish larvae at 144 h upon exposure to different concentrations of CAP. (*< 0.05, **< 0.01)

圖4 正常發(fā)育及畸形發(fā)育的斑馬魚胚胎

Figure 4 The embryos of zebrafish with normal and malformed development

圖 5 CAP暴露144 h對斑馬魚仔魚的SOD活性 (A) 和CAT活性 (B) 的影響

Figure 5 SOD activities (A) and CAT activities (B) of zebrafish larvae at 144 h upon exposure to different concentrations of CAP. (*< 0.05, **< 0.01)

3 討論

CAP作為選擇性抗腫瘤藥物, 廣泛運用于臨床, 相對于傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物5-FU, 具有更好的腫瘤細胞選擇性, 研究表明, 5-FU在斑馬魚的傳代過程中具有明顯的毒性效應(yīng), 這可能歸屬于其殺細胞作用, 由于斑馬魚胚胎期細胞增殖較快, 相對于成魚, 5-FU對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性較大[19]。由此, 作為前體的卡培他濱對增殖旺盛的正常細胞的毒性效應(yīng), 需進行系統(tǒng)地研究。

CAP的發(fā)育毒性 本研究通過模擬實驗研究了直接暴露在一定濃度的CAP溶液中對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)[20–21]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為0.2 μg·L-1時, 斑馬魚胚胎無論從孵化率、致死率方面, 以及24 h自主運動和72 h心跳次數(shù)方面, 都與對照組無明顯差異。當濃度增加到20 μg·L-1時, CAP對于斑馬魚胚胎的發(fā)育表現(xiàn)出明顯的毒性作用, 使胚胎孵化率明顯降低, 死亡率和畸形率明顯升高, 但對于自主運動和心跳次數(shù)并無明顯的抑制作用。當CAP濃度達2000 μg·L-1時, 其毒性更加明顯, 顯著降低了胚胎孵化率, 增加了胚胎死亡率和畸形率, 并能夠抑制胚胎的自主運動從而使胚胎脫膜困難, 抑制其心跳使其機能降低?？梢? CAP對于斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性及機能抑制作用具有明顯的劑量依賴效應(yīng), 即CAP對胚胎的毒性隨著CAP暴露濃度的升高而增加, 這與許多傳統(tǒng)環(huán)境毒性物質(zhì)的毒性效應(yīng)規(guī)律相似[10]。因此, 該現(xiàn)象除了揭示CAP對正常增殖細胞的毒性作用之外, 也提示我們關(guān)注CAP在生產(chǎn)應(yīng)用過程中進入環(huán)境后所引發(fā)的環(huán)境效應(yīng)。

氧化損傷機制研究 氧化損傷被認為是許多化合物毒性的作用機制之一, 目前多利用離體細胞或成年動物進行研究, 但離體細胞的培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境存在很大差異, 不能有效地推及到整體生物。很多研究發(fā)現(xiàn), 由于胚胎或幼體發(fā)育階段的特殊性, 對外界刺激的響應(yīng)機制并不完善, 因此, 相對于斑馬魚成體, 胚胎或者仔魚更能體現(xiàn)整體生物細胞的應(yīng)激水平[22]?；谝陨峡紤], 本研究以斑馬魚仔魚 (144 h)為研究對象, 通過探討CAP暴露對抗氧化系統(tǒng)的酶系的影響, 從氧化應(yīng)激的角度討論CAP毒理作用的機制。

SOD為超氧化物歧化酶, 是一種清除超氧陰離子的特異性功能酶, 可與超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng), 使其分解為H2O和O2, 維持機體的氧化和抗氧化平衡[23]。SOD的活性水平升高時, 提示機體遭受一定程度的氧化損傷, 而當機體SOD活性的顯著降低時, SOD酶的清除能力減弱, 表明所遭受的氧化損傷已超出機體自我修復(fù)的范圍而出現(xiàn)嚴重損傷[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 當暴露CAP濃度較低時, 其損傷仍在仔魚可修復(fù)范圍, 通過提高自身的SOD水平進行對抗, 而當CAP的暴露濃度增加到20 μg·L-1以上時, SOD活性明顯降低, 表現(xiàn)出極度損傷, 從死亡率等表觀指標也可發(fā)現(xiàn), 當暴露濃度升高到20 μg·L-1以上時, 死亡率, 畸形率等呈現(xiàn)較高的水平。同時也可以發(fā)現(xiàn), CAP對斑馬魚仔魚SOD活性的影響隨濃度增加呈降低趨勢。表明了CAP在高于一定濃度后, 能夠?qū)е屡咛ンw內(nèi)超氧陰離子增多, 超出SOD酶清除作用而損傷機體, 并反過來抑制SOD的活性。與斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率相一致, SOD的活性抑制程度隨著CAP濃度的增加而增大, 表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性, 結(jié)果表明, 氧化應(yīng)激系統(tǒng)損傷可能是導(dǎo)致斑馬魚畸形發(fā)育的潛在誘因。

CAT也是機體生物防御體系的關(guān)鍵酶之一, 也是氧化損傷的標志酶之一, 是過氧化物酶體的標志, 占過氧化物酶體總量的40%。CAT能夠有效地清除體內(nèi)的H2O2, 使機體免受H2O2的損害[25]。同樣, 當氧化損傷超過生物承受范圍則會造成生物體酶系的抑制, 即氧化應(yīng)激系統(tǒng)受到嚴重損傷[26]。本研究發(fā)現(xiàn), 與SOD活性規(guī)律相似, 當暴露在不同濃度的CAP溶液中時, 斑馬魚仔魚體內(nèi)CAT的活性同樣表現(xiàn)出濃度依賴性。當暴露CAP濃度較低時, 仔魚可通過提高自身的CAT水平對抗氧化損傷, 而當CAP的暴露濃度增加到20 μg·L-1以上時, CAT活性明顯降低, 表現(xiàn)出極度損傷。結(jié)合SOD與CAT活性變化可知, CAP對于斑馬魚的損傷呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。值得注意的是, 當CAP濃度增大到20 μg·L-1和2000 μg·L-1時, 斑馬魚幼仔體內(nèi)CAT的抑制程度并無明顯增強, 與斑馬魚的畸形發(fā)育率等現(xiàn)象有所不同。斑馬魚是一個復(fù)雜的生物體, 其行為學受到多種系統(tǒng)調(diào)控, 如氧化應(yīng)激系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等, 多數(shù)情況下, 生物的行為是受到多種調(diào)控系統(tǒng)共同作用的, 斑馬魚死亡率和畸形率增加有可能是又不僅僅是抗氧化系統(tǒng)損傷而誘發(fā), 值得我們后續(xù)進一步研究。

4 結(jié)論

斑馬魚胚胎直接暴露于CAP會引發(fā)一系列的毒性效應(yīng), 如死亡率、畸形率等的顯著升高, 斑馬魚胚胎機能的下降等。當CAP暴露濃度高于20 μg·L-1時, 有明顯的致死和致畸效應(yīng), 在48—56 h的敏感胚胎發(fā)育階段, CAP對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性具有一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系。CAP暴露對斑馬魚胚胎/仔魚的抗氧化指標均產(chǎn)生了較大的影響, SOD和CAT的活性均呈現(xiàn)低濃度升高, 高濃度降低的現(xiàn)象, 表明CAP對斑馬魚胚胎/仔魚發(fā)育階段產(chǎn)生氧化損傷, 進而引發(fā)一系列機能改變, 甚至導(dǎo)致死亡。

致謝: 本工作受到了山東省科技發(fā)展計劃項目 (2014GSF118121)和“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項2017年度立項課題(2017ZX09201003)資助, 并在山東省抗體藥物協(xié)同創(chuàng)新中心、山東省納米藥物與釋藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心、聊城市熱熔擠出藥物制劑工程技術(shù)研究中心、聊城市熱熔擠出藥物制劑工程實驗室、聊城市傳染病醫(yī)院中完成, 各平臺都給予了有力的支持。

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Development effects of Capecitabine on the non-target organism of zebrafish embryo

WANG Lili1, ZHAO Wenguang2, DING Zhuang1, WANG Zhengping1, ZHAO Yannan1, HAN Jun1,3,*

1. Liaocheng University, Institute of Biopharmaceutical Research, Liaocheng, Shandong 252000, China 2. Liaocheng Infectious Disease Hospital, Liaocheng,Liaocheng,Shandong 252000, China 3. Liaocheng Hi-tech Biotechnology Co., Ltd., Liaocheng,Shandong 252000, China

To investigate the deleterious effects of Capecitabine (CAP) on non-target aquatic organisms, the developmental toxicity of CAP to zebrafish embryos and its effects on the antioxidant enzymes of zebrafish fry were studied. The exposure experiment showed that CAP could cause death and deformity of zebrafish embryos. When the CAP exposure concentration was higher than 20 μg·L-1, the mortality rate andmalformation rate of the treated embryos were significantly higher than those of the control. In antioxidant enzyme activities assays, results revealed that when exposure to 0.2 μg·L-1CAP, the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities in zebrafish fry increased significantly (< 0.05), implying that low concentration of CAP could trigger the oxidative stress response of zebrafish. When the CAP concentration was higher than 20 μg·L-1, the SOD and CAT activities greatly decreased, indicating that the oxidative damage caused by CAP exceeded the restoration capability of zebrafish larvae and caused fatal injuries. In this paper, the developmental toxicity and oxidative stress were used to explore the potential hazards of CAP on the non-target organisms, and to provide a scientific basis for its ecological effects.

Capecitabine; non-target organism; zebrafish embryo; developmental toxicity; oxidative damage

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.04.013

X174

A

1008-8873(2019)04-085-06

2018-06-15;

2018-09-18

山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GSF118121); “重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項2017年度立項課題(2017ZX09201003); 山東省抗體制藥協(xié)同創(chuàng)新中心(聊城大學)開放課題項目(CIC-AD1828)

王利利(1987—), 女, 碩士研究生, 從事藥物在環(huán)境中的生態(tài)效應(yīng)研究, E-mail: 772897523@qq.com

韓軍, E-mail: junhanmail@163.com

王利利, 趙文廣, 丁壯, 等. 卡培他濱對非靶標生物斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性研究[J]. 生態(tài)科學, 2019, 38(4): 85-90.

WANG Lili, ZHAO Wenguang, DING Zhuang, et al. Development effects of Capecitabine on the non-target organism of zebrafish embryo[J]. Ecological Science, 2019, 38(4): 85-90.