屠友權(quán) 方春艷 呂 勤

(寧波市婦女兒童醫(yī)院，寧波315012)

病毒性腦炎是兒科常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,近年來在兒童中的發(fā)病率有增高趨勢,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛和抽搐，多數(shù)完全恢復(fù)，但少數(shù)遺留癲癇、癱瘓、智能發(fā)育遲緩等后遺癥，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，病毒感染后常在患兒體內(nèi)沿血行及神經(jīng)播散,引起炎性反應(yīng)及腦損傷，并導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的紊亂，淋巴細(xì)胞在該病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用；細(xì)胞因子又引起繼發(fā)性腦損傷[1，2]。本研究通過檢測病毒性腦炎患兒淋巴細(xì)胞亞群及腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平的變化，探討其在病毒性腦炎患兒發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 2015年1月～2018年1月寧波市婦女兒童醫(yī)院住院的病毒性腦炎患兒128例，年齡3～14歲，平均年齡(8.2±5.4)歲，其中男性68例(53.13%)，女性60例(46.87%)，重癥組66例,輕癥組62例，參照重型輕型病毒性腦炎診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組[3]。另選取同期在我院兒外科擇期手術(shù)腰椎間隙麻醉患兒60例作為對照組,男35例,女25例,其中隱睪25例,斜疝病25例,尿道下裂10例，無近期感染及過敏性疾病等病史,無免疫制劑應(yīng)用，并排除神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患兒,CSF常規(guī)、生化檢查無異常。所有研究對象沒有免疫系統(tǒng)疾病、進(jìn)行性肝病、腎病、惡性腫瘤、糖尿病、敗血癥或其他的感染性疾病。

1.2方法

1.2.1治療方法 輕型組入院后常規(guī)給予控制高熱、控制抽搐、脫水降顱壓、抗病毒等處理；重型組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予甲基強(qiáng)的松龍沖擊治療，用藥3 d，減量至1～2 mg/(kg·d)，用藥3～5 d，同時(shí)予大劑量IVIG靜脈輸注[1 g/(kg·d)]，用藥2 d，頻繁驚厥者加用丙戊酸鈉治療。

1.2.2T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 所有檢測者均用EDTA-K2抗凝管空腹抽靜脈血1.8 ml，經(jīng)相應(yīng)的熒光標(biāo)記單克隆抗體染色，避光室溫孵育20 min，用FACSLysing solution溶血處理，流式細(xì)胞儀測定CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+淋巴細(xì)胞亞群水平。

1.2.3腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平檢測 所有檢測者于入院24 h內(nèi)治療前行腰椎穿刺,收集腦脊液標(biāo)本，2 000 r/min離心10 min,取上清液置-80℃冰箱待測。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10含量,試劑盒來自美國BD公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1各組間淋巴細(xì)胞亞群比較 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+細(xì)胞水平在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD3+、CD4+、CD4+CD25+、CD4/CD8重型組低于輕型組和對照組(P<0.05)，CD8+、CD19+、CD16+CD56+重型組高于輕型組和對照組(P<0.05)；輕型組與對照組比較，CD3+、CD4+、CD16+CD56+、CD4+CD25+差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD8+、CD19+、CD4+/CD8+差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組間腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平比較 病毒性腦炎患兒腦脊液中TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),重型組高于輕型組和對照組(P<0.05)，輕型組高于對照組(P<0.05)。見表2。

2.3治療前后淋巴細(xì)胞亞群比較 CD3+、CD8+、CD19+、CD4+/CD8+細(xì)胞水平在治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD4+、CD16+CD56+、CD4+CD25+治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

GroupsnCD3+CD4+CD8+CD19+CD16+CD56+CD4+/CD8+CD4+CD25+Light group6259.20±8.301)32.74±6.251)26.99±7.012)21.05±3.952)12.60±1.491)1.30±0.452)5.94±2.171)Severe group6655.24±6.6729.86±4.8030.26±5.1326.52±7.2013.38±1.341.03±0.193.89±1.55Control group6064.23±6.1237.98±6.1825.60±6.2120.26±4.7911.88±1.781.43±0.698.06±2.36F25.0431.589.5224.2715.2711.2264.76P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

Note：Compared with the control group,1)P<0.05,2)P>0.05.

GroupsnTNF-αIL-2IL-6IL-10Light group6267.09±31.58378.46±122.9261.84±29.3119.37±9.14Severe group6687.78±33.39601.77±231.5487.61±18.1234.49±10.46Control group6030.23±11.3385.85±57.3429.90±15.716.38±0.77F68.19168.8993.54187.25P<0.05<0.05<0.05<0.05

GroupsnCD3+CD4+CD8+CD19+CD16+CD56+CD4+/CD8+CD4+CD25+Before treatment12857.18±7.7431.28±5.7228.65±6.3223.83±6.4213.01±1.481.16±0.364.91±2.14After treatment12862.55±4.7137.24±5.6725.63±4.3921.37±4.6712.09±1.771.46±0.738.03±1.99t-6.7-8.384.453.454.67-4.11-12.14P<0.05>0.05<0.05<0.05>0.05<0.05>0.05

GroupsnTNF-αIL-2IL-6IL-10Before treatment12877.59±34.01491.86±216.6974.93±27.42193.37±9.14After treatment12832.23±10.4281.86±40.3829.84±11.06 6.76±1.07t14.382118.2818.45P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.4治療前后腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平比較 腦脊液TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10水平治療前高于治療后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

病毒性腦炎主要由病毒感染及機(jī)體細(xì)胞免疫功能降低引起，以腦實(shí)質(zhì)炎癥為主的中樞系統(tǒng)疾病。病原體侵入機(jī)體及中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，可刺激激活機(jī)體免疫細(xì)胞，使之活化產(chǎn)生應(yīng)答，引起宿主對病毒抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，繼而引起神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致血管及其周圍腦組織損害。已有研究表明,病毒性腦炎的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，同時(shí)大量炎癥因子的產(chǎn)生和釋放又會破壞機(jī)體的免疫平衡，產(chǎn)生多種病理損傷[4，5]。

在本研究中，重型組CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+、CD4+CD25+較輕型組與對照組明顯降低(P<0.05)，CD3+代表T淋巴細(xì)胞水平，我們推測其降低表明重型組病毒性腦炎患兒T細(xì)胞免疫功能降低，CD4+是具有輔助性T細(xì)胞亞群，它可以刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，可以分為Th1和Th2兩種類型，它們通過所分泌的細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié)，正常情況下，二者處于相對平衡狀態(tài)以維持機(jī)體免疫功能的平衡，當(dāng)機(jī)體受到異?？乖碳r(shí)，上述平衡被打破，可引起異常的免疫應(yīng)答。Th1主要參與細(xì)胞免疫，其分泌的IL-2和TNF-α是其特征因子。Th2 細(xì)胞主要刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，參與體液免疫，維持著機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫正常的功能，其主要分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子。本研究結(jié)果顯示，病毒性腦炎患兒重型組和輕型組CD4+T淋巴細(xì)胞比對照組降低，其中Th1類細(xì)胞因子IL-2和TNF-α升高，Th2類細(xì)胞因子IL-6、IL-10也升高，其水平重型組高于輕型組，輕型組高于對照組，治療前高于治療后，我們分析過病毒性腦炎患兒盡管Th細(xì)胞減少，但免疫狀態(tài)異常，Th1和Th2類細(xì)胞因子同時(shí)升高，Th1/Th2比例失衡在其炎性反應(yīng)中起著重要作用。有研究表明病毒性腦炎的發(fā)生是Th1型細(xì)胞和Th2型細(xì)胞相互作用、相互反饋的過程[6，7]，病毒侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，活化的免疫細(xì)胞釋放IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，其分泌不平衡，不能維持Th1/Th2平衡，機(jī)體的促炎能力強(qiáng)于抑炎能力，對腦組織造成損害；也有報(bào)道病毒感染產(chǎn)生的TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10對未感染細(xì)胞是一種保護(hù)機(jī)制，促使機(jī)體建立抗病毒狀態(tài),阻止病毒擴(kuò)散，我們分析其在病毒性腦炎中也起到了抗病毒作用[8]。另一方面IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10水平和病情輕重及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，這與國內(nèi)相關(guān)報(bào)道一致[9]。另外，本研究中重型組和輕型組IL-2水平均較對照升高,重型組又高于輕型組，其水平隨著病情加重而升高，間接反映了腦損傷的嚴(yán)重程度，但I(xiàn)L-2自身并不具有抗病毒的功能，可能是IL-2與TNF-α、IL-6、IL-10構(gòu)成了炎癥因子系統(tǒng),共同參與腦組織神經(jīng)元損傷過程。有研究表明TBEV菌株感染后的小鼠腦組織IL-2 水平顯著升高[10]，IL-2對T細(xì)胞增殖有影響，外周感染TBEV后，外周組織如淋巴結(jié)和脾臟發(fā)生原發(fā)性T細(xì)胞活化，然后TBEV進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，T細(xì)胞浸潤腦部感染部位，提示IL-2是重癥腦炎致病關(guān)鍵因素。本研究中重型組CD8+T、CD19+B淋巴細(xì)胞較輕型組與對照組顯著升高(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞代表細(xì)胞毒性T 細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞，主要發(fā)揮特異性殺傷靶細(xì)胞的功能，從而引起靶細(xì)胞的溶解與凋亡，有利于病毒的清除，但同時(shí)這種特異性殺傷靶細(xì)胞的功能若過度激活，也對腦組織損害造成嚴(yán)重?fù)p害，有報(bào)道稱CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)可能是單純皰疹病毒性腦炎患者的腦損傷的重要病因[11];CD19+是B淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志分子，其在病毒性腦炎患兒中升高，與Atkinson等[12]報(bào)道一致，我們分析B淋巴細(xì)胞活化分化成熟為漿細(xì)胞，并分泌產(chǎn)生自身抗體，從而引起神經(jīng)組織的損傷，這是病毒性腦炎患兒的重要發(fā)病因素。重型組和輕型組CD16+CD56+比對照組明顯升高，CD16+56+代表的自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)是機(jī)體的第一道防御屏障，在清除病毒感染中起重要作用，病毒性腦炎患兒中其表達(dá)升高;我們推測患兒病毒刺激后應(yīng)激能力增強(qiáng)和其發(fā)病有關(guān)。但病毒性腦炎患兒重型組CD4+/CD8+比值較輕型組與對照組明顯降低，我們推測二者的免疫平衡功能紊亂在該疾病過程中起重要作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，抑制Th2細(xì)胞的分化而強(qiáng)化Th1細(xì)胞的活性。本試驗(yàn)中重型組和輕型組淋巴細(xì)胞CD4+CD25+較對照組明顯降低，我們推測CD4+CD25+減少對Th2 抑制作用減弱，導(dǎo)致Th1/Th2失衡，可能是病毒性腦炎發(fā)生的原因之一，有報(bào)道稱病毒性腦炎中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞存在缺陷[13]。

本研究結(jié)果顯示，病毒性腦炎患兒治療后CD3+、CD4+/CD8+較治療前升高，CD8+、CD19+較治療前降低，治療前后比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD3+治療后升高，表明T細(xì)胞免疫功能在升高；CD4+/CD8+比值在治療后升高，我們推測二者的免疫平衡功能在病情好轉(zhuǎn)時(shí)恢復(fù)，這對疾病預(yù)后有重要提示意義；CD8+細(xì)胞殺傷作用能夠清除病毒，治療后病毒載量減少，其激活也減少，同時(shí)也減輕了因其過度激活對正常腦細(xì)胞的損害[11]；CD19+分泌的抗體是病毒性腦炎患兒腦損傷的重要因素，治療后對抗原的特異性識別減少，產(chǎn)生抗體也相應(yīng)減少，因此B淋巴細(xì)胞水平下降，體液免疫功能恢復(fù)。雖然治療后CD4+、CD16+CD56+、CD4+CD25+和治療前比較差異不明顯，可能與樣本量和預(yù)后分組有關(guān)系，但也是在趨向好轉(zhuǎn)，我們分析淋巴細(xì)胞亞群水平和病情密切相關(guān)，治療后免疫功能的恢復(fù)有助于疾病的恢復(fù)。本研究中治療后IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10水平較治療前明顯降低，我們分析病毒性腦炎發(fā)病時(shí)病毒感染中樞系統(tǒng)引起炎癥反應(yīng)，這一過程產(chǎn)生了IL-2等細(xì)胞因子，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等藥物進(jìn)行治療后炎癥反應(yīng)被抑制，這些細(xì)胞因子含量也減少。

綜上所述，病毒性腦炎的發(fā)病及預(yù)后與T、B 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞功能紊亂及腦脊液IL-2、NF-α、IL-6和IL-10水平相關(guān)，其與病情進(jìn)展的相關(guān)性有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。