邢曉偉 郭 祥 涂源源

(?？谑腥嗣襻t(yī)院，海口570208)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)好發(fā)于間葉組織，其發(fā)病率占全人類惡性腫瘤中的0.2%,多發(fā)于10～20歲之間的青少年階段[1]，研究表明青少年OS發(fā)病占OS發(fā)病患者中的70%[2]。OS的發(fā)病特點(diǎn)主要是發(fā)生在干骺端，因其生長(zhǎng)極為迅速，在疾病的早期非常容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[3]。因此研究OS的發(fā)病機(jī)制，對(duì)深入了解疾病的發(fā)生發(fā)展以及靶向治療有著重要意義。

自噬是由細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)將受損細(xì)胞與被破壞蛋白與溶酶體共同融合降解的過程，對(duì)細(xì)胞正常功能及其內(nèi)穩(wěn)態(tài)起到維持作用[4]。目前有研究顯示自噬對(duì)OS的發(fā)生、發(fā)展以及治療具有重要的調(diào)節(jié)作用[5]。而另有研究表明通過調(diào)整microRNA(miR)可激活或抑制自噬[6]。miR作為一類長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼短鏈RNA，其主要作用是通過對(duì)其下游靶基因mRNA 3′端非翻譯區(qū)(Untranslated regions，UTR)進(jìn)行結(jié)合，對(duì)靶基因翻譯與轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行抑制，從而起到改變靶基因表達(dá)的效果[7,8]。miR-199a-3p作為miR家族中的一員，此前有研究表明miR-199a-3p在OS中存在低表達(dá)[9]，可能作為OS的潛在診斷標(biāo)志物，但是關(guān)于miR-199a-3p在OS中與自噬之間的關(guān)系并無相關(guān)研究。雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin，mTOR)作為一種蛋白激酶，具有重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用，參與機(jī)體生理與病理過程[10]，研究證明通過抑制mTOR可激活自噬與自噬體的形成[11]。并且本次研究通過miR靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-199-3p與mTOR之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，通過探究miR-199a-3p與mTOR在OS中的關(guān)系，進(jìn)一步探尋新的潛在治療方案，為臨床醫(yī)生治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 收集在本院進(jìn)行治療的OS患者15例，其中男9例，女6例，平均年齡(21.4±7.2)歲，手術(shù)收集患者OS組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織，切除后使用液氮保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，本次研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者通過影像學(xué)、組織活檢確診為OS患者，患者組織收集前并未進(jìn)行過放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者合并其他腫瘤，患者存在先天性免疫缺陷，患者存在其他骨關(guān)節(jié)疾病。

1.1.2細(xì)胞與試劑來源 人OS細(xì)胞U-2 OS、人成骨細(xì)胞hFOB、人胚腎細(xì)胞293t(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，HTB-96，CRL-11372，ACS-4500)；psiCHECK-2-2質(zhì)粒(中國(guó))；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，40302ES20)；RPMI1640培養(yǎng)基、FBS(牛胎血清)、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗、TRIzol提取試劑、ECL發(fā)光化學(xué)檢測(cè)試劑盒、LipofectAMINE 2000試劑盒、RIPA、BCA蛋白試劑盒(中國(guó)上海Thermo Fisher Scientific，61870044，10437028，90058，15140163，12183555，35050，11668019，23225、15224041)；PCR試劑盒TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，TransScript Ⅱ Green Two-Step qRT-PCR SuperMix(中國(guó)北京全式金生物有限公司，AT351-01，AQ301-01)；Anti-mTOR antibody、Anti-Bax antibody、Anti-Bcl-2 antibody、Anti-LC3A/B antibody、β-Actin、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Abcam公司，ab2732，ab32503，ab185002，ab128025，ab124964，ab6721)；雙熒光酶素檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega，E1910)CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(中國(guó)上海Beyotime Biotechnology，C0037)；miR-199a-3p模擬物序列、無關(guān)序列、miR-199a-3p、mTOR引物序列由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 U-2 OS細(xì)胞與hFOB細(xì)胞分別置于RPMI1640培養(yǎng)基(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素雙抗，10%FBS)中,在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)U-2 OS細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取細(xì)胞將其密度調(diào)整至5×105個(gè)/孔，分別接種至6孔板中，觀察細(xì)胞融合情況，當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒，按照試劑盒說明書對(duì)U-2 OS細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞共分為空白組、無關(guān)序列組(NC組)、過表達(dá)組(miR-199-3p-mimic組)，轉(zhuǎn)染濃度為20 nmol/L，共轉(zhuǎn)染48 h。

1.2.2CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U-2 OS細(xì)胞0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，使用PBS洗滌，進(jìn)行重懸將密度調(diào)至1×105個(gè)/ml，分別接種于96孔板中，每孔加入100 μl細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)序列，溫育48 h，隨后每孔加入10 μl CCK-8試劑，37℃條件下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)進(jìn)行吸光度檢測(cè)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.2.3細(xì)胞與組織中miR-199a-3p與mTOR相對(duì)表達(dá)檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染U-2 OS、hFOB細(xì)胞、患者組織，采用TRIzol提取試劑進(jìn)行總RNA的提取，將提取后的總RNA使用紫外分光光度儀與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA純度、濃度與完整性。miR-199a-3p檢測(cè)方法如下：使用PCR試劑盒中自帶的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)與總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.4 μl，2×TransTaq?Tip Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye(×50)0.4 μl，最后加入ddH2O補(bǔ)全至20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共進(jìn)行40循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次。本次研究使用U6作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt對(duì)本次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。mTOR檢測(cè)方案如下，使用PCR試劑盒中自帶的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.4 μl，2×TransScript?Tip Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye(50×)0.4 μl，最后加入Nuclease-free Water補(bǔ)全至20 μl，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共進(jìn)行40循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次。本次研究使用GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt對(duì)本次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用美國(guó)ABI公司 7500PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。引物序列見表1。

1.2.4Western blot(WB)檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞使用RIPA裂解法提取總蛋白，使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整至4 μg/μl，12%SDS-PAGE電泳分離,電離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，使用麗春紅工作液中染色，PBST浸泡5 min洗滌，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/Ⅰ一抗(1∶1 000)4℃封閉過夜。洗膜除去一抗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min。暗室中顯影，用濾紙吸干膜上多余液體，ECL發(fā)光，顯影。掃描蛋白條帶，于Quantity One軟件中分析灰度值，其中蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白質(zhì)條帶灰度值/β-Actin蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.2.5細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，消化后使用PBS洗滌2遍，加入100 μl的結(jié)合緩沖液，將其配制成1×106個(gè)/ml懸液，依次加入Annexin V-FITC與PI，室溫避光孵育5 min，使用FC500MCL流式細(xì)胞儀系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.6靶基因預(yù)測(cè)與雙熒光酶素報(bào)告 采用Targetscan7.2與miRwalk預(yù)測(cè)miR-199a-3p下游靶基因，分別將含有野生型與突變型mTOR 3′UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒、psiCHECK-2質(zhì)粒(美國(guó)Promega公司，C8021)、miR-199a-3p-mimic及其對(duì)照轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染48 h后采用，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，最后收集細(xì)胞采用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1OS患者組織與細(xì)胞中miR-199a-3p、mTOR相對(duì)表達(dá)情況 RT-qPCR檢測(cè)患者癌組織與癌旁組織中miR-199-3p、mTOR相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示患者癌組織中miR-199a-3p表達(dá)明顯低于癌旁組織，而癌組織中mTOR表達(dá)明顯高于癌組織嗎，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，U-2 OS細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)明顯低于hFOB細(xì)胞，而U-2 OS細(xì)胞中mTOR表達(dá)明顯高于hFOB細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2U-2 OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-199a-3p與mTOR相對(duì)表達(dá)情況 RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后U-2 OS細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)，結(jié)果顯示miR-199a-3p-mimic組細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)情況明顯高于NC組與空白組(F=36.631，P<0.001)，NC組與空白組比miR-199a-3p表達(dá)無差異，而檢測(cè)mTOR相對(duì)表達(dá)結(jié)果顯示miR-199a-3p-mimic組細(xì)胞中mTOR表達(dá)情況明顯低于NC組與空白組(F=17.901，P=0.030)，NC組與空白組比miR-199a-3p表達(dá)無差異，見圖2。

2.3細(xì)胞增殖情況 RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后U-2 OS細(xì)胞48 h相對(duì)增殖情況， 發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p-mimic組細(xì)胞增殖情況明顯受到抑制低于NC組與空白組(F=11.944，P=0.008)，NC組與空白組比相對(duì)增殖情況不存在差異，見圖3。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneUpstream primerDownstream primermiR-199a-3p5′-GCCACAGTAGTCTGCACAT-3′5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′mTOR5′-AGGCCTTGGTGAGAGCTGTA-3′5′-GGCACACATTTGAAGAAGCA-3′U65′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′GAPDH5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′

2.4細(xì)胞凋亡情況 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示空白組(16.77±1.84)與NC組(3.25±0.75)細(xì)胞凋亡情況明顯要低于miR-199a-3p-mimic組(3.38±0.84)(F=116.783，P<0.001)，而空白組與NC組細(xì)胞凋亡情況不存差異，見圖4。

2.5轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)情況 WB檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示miR-199a-3p-mimic組細(xì)胞中Bax、LC3-Ⅱ蛋白與LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯高于NC組與空白組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而mTOR、Bcl-2、LC3-Ⅰ 蛋白表達(dá)明顯低于NC組與空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NC組與空白組mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ 及LC3- Ⅱ/Ⅰ 比值無明顯差異(P>0.05)，見圖5。

圖1 細(xì)胞與組織中miR-199a-3p 與mTOR 相對(duì)表達(dá)情況Fig.1 Relative expression of miR-199a-3p and mTOR in cells and tissuesNote: A.Relative expression of miR-199a-3p in tissues；B.The relative expression of mTOR in tissues；C.Relative expression of microRNA-199a-3p in cells；D.Relative expression of mTOR in cells.*.P<0.05，***.P<0.001.

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-199a-3p相對(duì)表達(dá)Fig.2 Expression of miR-199a-3p after cell transfectionNote: **.P<0.01,***.P<0.001.

2.6miR-199a-3p與mTOR靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與雙熒光酶素報(bào)告 通過Targetscan7.2與miRwalk在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p與mTOR之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，因此我們通過雙熒光酶素報(bào)告進(jìn)行了驗(yàn)證。psiCHECK-2-2-mTOR-WT組中miR-199a-3p-mimic熒光素酶活性明顯低于無關(guān)序列組(P<0.05)，而psiCHECK-2-2-mTOR-MUT組中miR-199a-3p-mimic與無關(guān)序列組熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，見圖6。

圖3 48 h 細(xì)胞相對(duì)增殖情況Fig.3 Relative proliferation of cells at 48 hNote: **.P<0.01.

圖4 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.4 Flow cytometryNote: A.Apoptosis in miR-199a-3p-mimic group;B.Apoptosis in NC group;C.Apoptosis in blank group.

圖5 mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expression of mTOR,Bax,Bcl-2,LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ proteins

圖6 雙熒光酶素報(bào)告Fig.6 Double fluorescent enzyme reportNote: *.P<0.05.

3 討論

OS是一種常見于青少年的原發(fā)惡性腫瘤，并且多發(fā)于長(zhǎng)骨干骺端，研究表明OS每年發(fā)病率為3/100萬，并且女性患者發(fā)病率略高于男性[12，13]。目前臨床上常通過術(shù)前輔助化療，手術(shù)切除以及術(shù)后輔助化療的方案來改善患者病情[14]。隨著醫(yī)療水平的不斷提升OS患者的預(yù)后與生存率得到了顯著改善，但是其5年生存率還是不超過70%[15]。是否能進(jìn)一步提升患者生存率，是臨床醫(yī)生與科研人員亟待解決的難題之一。

miRNA是近年來的研究熱點(diǎn)，在多種細(xì)胞的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，與細(xì)胞的分化、形態(tài)及腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[16]。miR-199a-3p作為一種高度保守的miRNA，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)，Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p可通過抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡。Li等[18]研究顯示miR-199a-3p通過下調(diào)SerpinE2參與糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制與進(jìn)展，Qu等[19]研究表明miR-199a-3p通過靶向Smad1抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。上述研究顯示miR-199a-3p參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，可作為多種腫瘤或疾病的潛在治療靶點(diǎn)。但是在OS中是否具有同樣的作用，研究較少。因此本文研究miR-199a-3p在OS中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

本次研究我們首先檢測(cè)了OS患者癌組織與癌旁組織中miR-199a-3p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)患者癌組織中miR-199a-3p表達(dá)明顯降低，Duan等[20]研究通過芯片篩查發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在癌組織中的表達(dá)同樣低于癌旁組織，這與我們的研究結(jié)果相似，并且我們還通過檢測(cè)U-2 OS細(xì)胞與hFOB中miR-199a-3p的表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證，其表達(dá)與患者組織中的表達(dá)相似，驗(yàn)證了其正確性。但是關(guān)于miR-199a-3p在OS中的相關(guān)機(jī)制尚不清楚，我們進(jìn)一步將其過表達(dá)轉(zhuǎn)染至U-2 OS細(xì)胞中，通過觀察細(xì)胞增殖與凋亡情況，發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p-mimic組中細(xì)胞凋亡情況明顯增加，而細(xì)胞增殖情況明顯受到抑制，并且通過檢測(cè)miR-199a-3p-mimic組中凋亡蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)Bax蛋白表達(dá)明顯上升，而Bcl-2表達(dá)明顯降低，這提示我們通過過表達(dá)miR-199a-3p可有效抑制細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而關(guān)于是通過何種方式來抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡尚不清楚。自噬是一種細(xì)胞通過自我吞噬的代謝途徑，其通過降解與回收細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器，來維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[21]。研究表明自噬不僅可維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)還參與了多種病理過程[22]。mTOR作為細(xì)胞增長(zhǎng)、增殖、分化等重要生物學(xué)功能的調(diào)控因子，具有重要的生物調(diào)節(jié)作用，不僅如此其還可對(duì)自噬過程中自噬體形成起到抑制作用[23]。研究顯示通過抑制mTOR的表達(dá)而激活自噬的發(fā)生[24]。我們通過miRNA靶基因在線預(yù)測(cè)工具篩查發(fā)現(xiàn)mTOR與miR-199a-3p之間存在靶向結(jié)合點(diǎn)位，通過雙熒光酶素報(bào)告證實(shí)了兩者之間存在靶向結(jié)合關(guān)系。為此我們推測(cè)miR-199a-3p能通過抑制mTOR的表達(dá)從而激活自噬的發(fā)生。因此我們對(duì)細(xì)胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。LC3-Ⅱ/Ⅰ比值作為自噬的標(biāo)志物，其表達(dá)的高低可直接反映自噬情況[24]。我們通過檢測(cè)miR-199a-3p-mimic組中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p-mimic組中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值表達(dá)明顯上升，而在Wang等[25]人的研究中顯示通過黃芩素上調(diào)了DDIT4的表達(dá)，從而有效抑制mTOR的表達(dá)，激活了自噬的發(fā)生，而我們的研究正是通過調(diào)節(jié)mTOR上游靶基因來改變mTOR的表達(dá)引起自噬，這提示miR-199a-3p可能是治療OS新的潛在治療靶點(diǎn)。

本次研究初步證明了過表達(dá)miR-199a-3p抑制mTOR的表達(dá)從而引起自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。但是我們本次研究還是存在一定的局限性，首先我們并沒有建立miR-199a-3p抑制組，通過抑制miR-199a-3p的表達(dá)對(duì)OS細(xì)胞存在什么樣的影響尚不清楚，其次我們僅檢測(cè)了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值并未對(duì)其他自噬形成標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，最后我們?cè)趍iR-199a-3p靶基因預(yù)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)DDIT4與miR-199a-3p同樣存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-199a-3p是否可通過調(diào)節(jié)DDIT4的表達(dá)間接調(diào)控mTOR尚不清楚。因此我們希望在今后的研究中增加我們的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，進(jìn)一步探究miR-199a-3p與DDIT4之間的關(guān)系來補(bǔ)充我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，過表達(dá)miR-199a-3p可抑制mTOR的表達(dá)引起細(xì)胞自噬,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡降低細(xì)胞增殖。