王宏英 魏海峰 王衛(wèi)芳 周曉晶 郭艷霞 米旭光 劉 磊 方艷秋

(長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，長春130021)

腎癌，又稱為腎細胞癌、腎腺癌，起源于泌尿小管上皮，腎癌約占成人惡性腫瘤的2%～3%，占成人腎臟惡性腫瘤的80%～90%。目前腎癌的治療主要依靠手術(shù)及化學(xué)藥物，化療藥物的作用主要是抑制癌細胞增殖，誘導(dǎo)癌細胞分化，或啟動癌細胞凋亡。研究表明，自然界中一些含有酚類化合物的植物具有抗癌的特性[1-3]，并不斷有新的具有抗癌功效的酚類化合物被發(fā)現(xiàn)[4]。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在腫瘤防治上具有獨特的優(yōu)勢，我國藥典上收載的單寧酸具有多方面的藥理活性，具有顯著的抗炎、抗氧化、降糖、降脂、抗腫瘤等作用[5-7]。本實驗發(fā)現(xiàn)單寧酸(Tannic acid,TA)能顯著抑制人腎癌細胞OS-RC-2的生長。實驗結(jié)果為TA作為新藥應(yīng)用提供了有價值的資料。

1 材料與方法

1.1材料 人腎癌細胞OS-RC-2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，CCK-8試劑盒購自日本同仁，ROS 試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒均購自北京碧云天生物技術(shù)公司，2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)、TA購自Sigma公司，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)及總超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，8-羥基脫氧鳥苷(8-Oxo-deoxyguanosine,8-OHdG)及細胞間黏附因子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)ELISA檢測試劑盒購自美國RND公司，β-actin、Bcl-2、Bax、和Caspase-3抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將腎癌細胞OS-RC-2置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，隔日用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代備用。

1.2.2CCK8法檢測細胞增殖 收集處于對數(shù)生長期的OS-RC-2細胞，制成單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種到96孔板，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度TA(20、40、80和100 μmol/L)，置37℃培養(yǎng)箱作用48 h，同時設(shè)置空白調(diào)零組(不加細胞加入等量的雙蒸水)，以及陰性對照組(加細胞加入等量的雙蒸水)。藥物作用結(jié)束前1 h，各孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀測450 nm處OD值，實驗重復(fù)3 次。細胞存活率(%)=[(實驗組OD值-空白調(diào)零組OD值)/(對照組OD值-空白調(diào)零組OD值)]×100%。

1.2.3OS-RC-2細胞形態(tài)學(xué)觀察 按每孔5 000個數(shù)量將OS-RC-2細胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入TA(40、80和100 μmol/L)，設(shè)空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 分別取對數(shù)生長期細胞，用胰酶消化并計數(shù)，OS-RC-2細胞按2×105個/ml將1 ml的細胞混懸液分別接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后，待細胞融合達80%左右時，給藥組使含TA量分別為40、80和100 μmol/L，并設(shè)置不含TA的對照組。將其置于CO2培養(yǎng)箱(37℃)培養(yǎng)24、48、72 h后，胰酶消化離心后，冷PBS洗滌細胞2次，然后加入1×結(jié)合緩沖液使細胞再次懸浮，并使細胞密度達1×106個/ml；分別移出100 μl(細胞數(shù)為1×105個)細胞懸液至多個5 ml培養(yǎng)管內(nèi)；相應(yīng)地加入5 μl V-FITC或PI輕微地渦動細胞并在避光溫箱(25℃)中孵育20 min，每管中添加400 μl的1× 結(jié)合緩沖液,用流式細胞儀在1 h內(nèi)檢測。

1.2.5DCF法測定細胞內(nèi)ROS 將OS-RC-2細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞。給予不同濃度的含TA(20、40和80 μmol/L)培養(yǎng)液，24 h后用PBS洗2次，并換上終濃度為25 μmol/L DCFH-DA，放置于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，孵育結(jié)束后，用PBS再洗滌2次，使用酶標(biāo)儀檢測熒光、488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長。

1.2.6化學(xué)顯示法檢測抗氧化酶活性 細胞以1×106個/ml密度接種于六孔培養(yǎng)板，各組細胞經(jīng)處理后，取細胞上清液測GSH-Px、SOD的活性，取細胞裂解液測MDA含量，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7ELISA法細胞上清中ICAM-1蛋白表達 細胞以1×106個/ml密度接種于六孔培養(yǎng)板，各組細胞經(jīng)處理后24 h，取細胞上清液檢測ICAM-1蛋白表達水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.8Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達 接種OS-RC-2細胞5×105個/25 cm2培養(yǎng)瓶，分別加入 80 μmol/L TA，空白對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，作用48 h。收集細胞，PBS 洗滌后用50 μl 1×SDS裂解。提取蛋白后測定濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，2%BSA封閉過夜，加入β-actin、Bcl-2、Bax和Caspase-3 抗體，4℃ 孵育過夜。TBST漂洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光劑溫育后暗室顯影，膠片曝光拍照。計算機圖像分析軟件進行分析，以特異性條帶平均吸光度與面積的乘積來反映蛋白的表達水平。

2 結(jié)果

2.1TA對OS-RC-2細胞生長的抑制作用 TA可有效抑制OS-RC-2腎癌細胞增殖，呈顯著劑量效應(yīng)關(guān)系，OS-RC-2細胞經(jīng)不同濃度TA(20、40、80和100 μmol/L)作用48 h后，細胞存活率分別為81.4%、72.9%、61.3%和38.2%，與對照組相比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2TA對OS-RC-2細胞形態(tài)學(xué)的影響 倒置顯微鏡下觀察，不同濃度TA作用于OS-RC-2細胞48 h后，可見對照組細胞生長圓潤飽滿，輪廓清楚，細胞間接觸緊密。給藥組細胞隨藥物濃度升高細胞數(shù)量明顯減少，細胞的體積變小、細胞間接觸松散。細胞出現(xiàn)皺縮變形，部分細胞輪廓模糊，甚至碎裂、脫落。尤其是100 μmol/L TA組最為明顯，見圖1。

2.3TA對OS-RC-2細胞內(nèi)ROS生成的影響 不同濃度的TA對OS-RC-2腎癌細胞內(nèi)ROS的影響并不一致。與對照組比較，20、40 μmol/L組ROS產(chǎn)量明顯增多，與對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，40 μmol/L組ROS產(chǎn)量顯著多于20 μmol/L 組(P<0.05)；但80 μmol/L組ROS產(chǎn)量卻并無顯著增多，與對照組相比，未見差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖1 TA對OS-RC-2腎癌細胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effect of TA on cell morphology of OS-RC-2 renal cell carcinomaNote: A.Negative control；B.40 μmol/L TA group；C.80 μmol/L TA group；D.100 μmol/L TA group.

2.4TA對OS-RC-2腎癌細胞凋亡的影響 在40、80和100 μmol/L 濃度的TA作用下，OS-RC-2細胞隨著藥物劑量的加大，作用時間的延長，凋亡細胞的百分率逐漸增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.5TA對OS-RC-2細胞中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及抗氧化酶活性的影響 實驗結(jié)果表明，腎癌細胞中MDA含量隨著TA濃度的增加而增加，而GSH-Px及SOD的活性逐漸降低，組間差異亦具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

2.6TA對OS-RC-2細胞培養(yǎng)上清中ICAM-1蛋白表達的影響 TA作用于OS-RC-2細胞24 h后，高劑量TA組細胞分泌ICAM-1蛋白水平呈下降趨勢，80和100 μmol/L TA組細胞分泌的ICAM-1蛋白水平分別為(887.49±19.26)pg/ml、(796.15±27.40)pg/ml，與空白對照組(1 025.33±23.47)pg/ml比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

GroupsConcentration(μmol/L)ROS(DCF value)Control036.16±4.26TA20 49.81±12.431)40 78.46±9.672)3)8041.52±10.08

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group；3)P<0.05 vs 20 μmol/L TA group.

GroupsConcentration(μmol/L)Percentage of apoptotic cells(%)24 h48 h72 hControl03.26±0.546.54±0.419.65±0.57TA405.07±0.481)11.28±0.572)15.47±0.492)808.24±0.652)19.26±0.442)31.54±0.332)10013.71±0.492)28.11±0.562)53.47±0.422)

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group.

GroupsConcentration(μmol/L)MDA(nmmol/g prot)GSH-Px(mg/g prot)SOD(U/g prot)Control05.28±0.64462.04±25.4739.59±0.94TA205.92±0.31432.58±18.4635.87±1.071)406.03±0.28403.29±9.491)29.52±1.712)3)807.17±0.491) 356.28±10.922)3)24.45±0.832)3)

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group；3)P<0.05 vs 20 μmol/L TA group.

圖2 TA對OS-RC-2細胞內(nèi)Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.2 Effect of TA on expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in OS-RC-2 cellsNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs control group.

2.7TA對OS-RC-2細胞內(nèi)Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達的影響 如圖2所示，80 μmol/L TA作用于OS-RC-2細胞48 h后，細胞核中Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)；Bax蛋白及凋亡蛋白Caspase-3表達明顯上調(diào)(P<0.05)。

3 討論

TA在藥典上又稱鞣酸、鞣質(zhì)、五倍子TA，是一類復(fù)雜的高分子多元酚類化合物，屬于水解類單寧。由于TA的分子量比較大，其成分在植物中相當(dāng)復(fù)雜，往往同一植物內(nèi)同時存在不同結(jié)構(gòu)而性質(zhì)相近的各種TA，加之其化學(xué)結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，給進一步分離提純帶來麻煩，限制了其作為中藥制劑的發(fā)展。在多數(shù)情況下，TA一般都作為雜質(zhì)除去。近年來，由于天然有機化合物分離、精制技術(shù)的提高，藥理實驗動物模型不斷出現(xiàn)、逐漸成熟，大量研究不僅闡明了千余種新的TA化合物結(jié)構(gòu)，而且發(fā)現(xiàn)TA具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多方面的藥理作用。近年來，關(guān)于TA的抗腫瘤作用的研究日益增多，例如Nie等[8]研究表明，TA可以作為天然脂肪酸合成酶(Fas)抑制劑，下調(diào)乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞Fas的表達，并誘導(dǎo)癌細胞凋亡；TA還可通過抑制JAK2/STAT3信號通路，參與誘導(dǎo)細胞G1期停滯及線粒體凋亡途徑，抑制牙齦癌細胞YD-38的增殖并促進凋亡[9]。此外，TA在癌癥化療中還具有一定的輔助作用，如其可以改善阿霉素的心臟毒性并增強其化療療效[10]，提示TA具有潛在的抗腫瘤作用，深入研究其藥理活性，將對惡性腫瘤的治療很有意義。本研究發(fā)現(xiàn)，TA對腎癌細胞OS-RC-2生長具有顯著的抑制作用，并可促進腫瘤細胞的凋亡，呈劑量、時間依賴性。為了探討其機制，首先檢測了TA對OS-RC-2細胞內(nèi)ROS生成的影響，結(jié)果表明，與對照組比較，20 μmol/L及40 μmol/L組ROS產(chǎn)量明顯增多，與對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。腫瘤細胞內(nèi)ROS的含量處于一種非平衡狀態(tài)，是其調(diào)控腫瘤分化、凋亡的基礎(chǔ)。ROS對于腫瘤細胞信號通路的調(diào)控具有兩面性，一方面ROS可加快腫瘤細胞增殖、分化、血管生成和激活轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；另一方面，高濃度的ROS可誘導(dǎo)細胞凋亡，促進細胞衰老和抑制細胞周期。因此說ROS是腫瘤進展的雙刃劍。目前有些新型化療藥物的殺瘤機制即為誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)部產(chǎn)生高濃度ROS。但本研究中80 μmol/L組ROS產(chǎn)量卻并無顯著增多，推測可能與腎癌細胞大量死亡，導(dǎo)致總ROS產(chǎn)量下降有關(guān)。研究結(jié)果還表明，腎癌細胞中MDA含量隨著TA濃度的增加而增加，而抗氧化酶活性GSH-Px及SOD的活性逐漸降低。有類似的研究證實，TA能夠增加人白血病HL-60細胞內(nèi)超氧化物水平，同時降低MDA水平，從而促進細胞凋亡和抑制細胞增殖[11]。因此通過本部分實驗可以推測，誘導(dǎo)腎癌細胞內(nèi)ROS增多并調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性可能是TA抑制腎癌細胞生長的機制之一。

ICAM-1是免疫蛋白超家族黏附分子，廣泛表達于單核細胞、淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞和癌細胞表面，參與許多生理和病理過程中細胞間信號的傳導(dǎo)，包括腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[12]。本研究首次觀察了TA對腎癌細胞培養(yǎng)上清中ICAM-1蛋白表達的影響，結(jié)果表明TA可降低OS-RC-2細胞ICAM-1蛋白的分泌，推測TA可通過此機制減少細胞間接觸，防止細胞集聚從而抑制其增殖。在體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境中，此作用還可抑制炎細胞的積聚，抑制因炎細胞活化而誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生及發(fā)展。此外實驗結(jié)果還表明，TA 可下調(diào)OS-RC-2細胞核中Bcl-2蛋白表達，并上調(diào)Bax蛋白及凋亡蛋白Caspase-3的表達，推測單寧酸的抗腫瘤作用還包括靶向線粒體凋亡途徑來誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。

綜上，癌癥是一種多因素誘導(dǎo)發(fā)生疾病，因此有必要尋找有效的多靶點治療方法。由于單寧酸抗腫瘤活性具有多靶點、多效應(yīng)，可作用于癌癥發(fā)生、發(fā)展的多個階段，同時其毒副性較小，因此可作為化學(xué)增敏劑以克服一些化療藥物的耐藥性，以達到輔助治療的效果，從而為癌癥的臨床治療方案提供一定的理論依據(jù)，單寧酸在腎癌防治上無疑顯示出潛在的藥用價值。