王維　葉世蕓　殷少文　鄭立肯

摘要?[目的]測定黔產(chǎn)青錢柳在不同炮制溫度及不同生長年限下總?cè)坪康淖兓源_定青錢柳產(chǎn)地加工的最佳溫度和生長年限對其品質(zhì)影響的差異。[方法]通過正交試驗(yàn)，樣品用30倍量的70%乙醇，超聲提取40?min，顯色后，在546.5?nm的波長下測定其吸光度。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測定其總?cè)频暮?。[結(jié)果]齊墩果酸濃度在0.004?1～0.024?6?mg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系（r=0.999?7），平均加樣回收率為99.55%，RSD為2.24%（n=6），該方法可靠。不同干燥溫度和生長年限對黔產(chǎn)青錢柳中總?cè)坪康挠绊懢哂酗@著差異，干燥溫度在80?℃時(shí)，總?cè)频暮扛哂谄渌谥茰囟认碌?，并且高溫和低溫條件下，青錢柳的色澤加深，影響到成品的外觀性狀。[結(jié)論]青錢柳的最佳干燥溫度為80?℃，由于不同生長年限中總?cè)坪康牟町悷o規(guī)律可尋，有待進(jìn)一步研究確定。

關(guān)鍵詞?青錢柳;干燥溫度;生長年限;總?cè)?紫外分光光度法;產(chǎn)地加工

中圖分類號?R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）16-0205-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.058

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Optimization?of?Content?Determination?of?Total?Triterpenoids?in?the?Cyclocarya?paliurus?（Batal.）?Iljinskaja?of?Guizhou?and?Its?Origin?Processing?Research

WANG?Wei1，YE?Shi?yun1，YIN?Shao?wen2?et?al?（1.Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，Guiyang，Guizhou?550000;?2.Guiyang?Third?People′s?Hospital，Guiyang，Guizhou?550000）

Abstract?[Objective]The?research?aimed?to?determine?the?change?of?total?triterpenoid?content?in?different?processing?temperatures?and?different?growth?period?of?Cyclocarya?paliurus，?and?to?determine?the?difference?in?the?optimum?temperature?and?growth?period?of?the?origin?processing?of?Cyclocarya?paliurus.[Method]By?orthogonal?experiment，the?sample?was?extracted?with?70%?ethanol?of?30?times，ultrasonic?extraction?of??40?min，?and?then?the?absorbance?was?determined?at?the?wavelength?of?546.5?nm.The?oleanolic?acid?was?used?as?a?standard?to?determine?the?total?triterpenoid?content.[Result]The?content?of?the?oleanolic?acid?showed?a?better?linear?relationship?with?the?absorbance?in?the?range?of??0.004?1-0.024?6?mg/mL（r=0.999?7）.The?average?recovery?was?99.55%，RSD?was?2.24%（n=6）.The?method?was?reliable.Different?drying?temperature?and?growth?period?of?triterpenoid?content?in?Cyclocarya?paliurus?had?significant?difference，when?the?influence?of?drying?temperature?was?80?℃，the?content?of?total?triterpenes?was?higher?than?other?processing?temperature，the?colour?and?lustre?of?Cyclocarya?paliurus?deepen?at?high?and?low?temperature?conditions，the?impact?to?the?finished?product?appearance.[Conclusion]The?best?drying?temperature?of?Cyclocarya?paliurus?was?80?℃.Because?the?difference?of?total?triterpenoid?content?in?different?growth?years?is?irregular，it?needs?further?research?and?determination.

Key?words?Cyclocarya?paliurus?（Batal.）?Iljinskaja;Drying?temperature;Growing?years;Total?triterpenoids;UV-spectrophotometry;Origin?processing

青錢柳（Cyclocarya?paliurus（Batal）?Iljinskaja）是我國特有的單種屬高大速生喬木，系胡桃科青錢柳屬，在我國各地廣泛分布，在貴州省黔東南苗族自治州有大量的野生資源[1-2]，這為當(dāng)?shù)氐那噱X柳種質(zhì)的研究和種植提供了豐富的資源。在政府的大力支持下，已建立了33.3?hm2的種苗培育基地。青錢柳具有顯著地降低血糖[3-7]、調(diào)節(jié)血脂[8-9]、降血壓[10-12]的作用而備受醫(yī)生學(xué)者關(guān)注。

近些年，有大量的文獻(xiàn)報(bào)道青錢柳具有抗氧化[13-14]、抗腫瘤、提高免疫力[15]的生物活性，青錢柳中的三萜類化合物具有抗菌[16]、減輕β胰島細(xì)胞的損傷和抑制凋亡[17]、調(diào)節(jié)酪氨酸蛋白的磷酸化平衡[18]，促進(jìn)小鼠胚胎成纖維脂肪細(xì)胞對葡萄糖的消耗等作用[19]，三萜類化合物是青錢柳的有效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，包括熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅素酸和白樺脂酸等。熊果酸和齊墩果酸對三酰甘油和膽固醇的吸收、合成和代謝都有調(diào)控作用，通過過氧化物酶體增殖物促進(jìn)受體的激活、（PPAR）-α表達(dá)和擬胰島素樣作用以及調(diào)控脂肪細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)和分化，以控制脂質(zhì)合成、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的各種關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，從而對抗白色脂肪形成和脂肪細(xì)胞激素的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)棕色脂肪骨骼肌和棕色脂肪生長、增加機(jī)體能量消耗。熊果酸、齊墩果酸能穩(wěn)定葡萄糖、脂質(zhì)和能量在體內(nèi)平衡，其是選擇性G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體TGR5激動劑[20]。山楂酸可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖及遷移，并抑制由肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，這種抑制作用可能是抑制NF-κb通路和激活線粒體凋亡通路所實(shí)現(xiàn)[21-22]?？屏_索酸對CaSki宮頸癌上皮細(xì)胞的抑制增殖和促凋亡的作用是調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路得以實(shí)現(xiàn)。白樺脂酸在一定的濃度范圍內(nèi)能夠增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）對SW1990胰腺癌細(xì)胞有殺傷作用，其可能通過促進(jìn)NK細(xì)胞增殖，抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，能激活NK調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK信號通路，提高NK細(xì)胞顆粒酶B、穿孔素、γ-干擾素和CD107a的表達(dá)[23]。

筆者以青錢柳中總?cè)苹衔锏暮繛橹笜?biāo)，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法來優(yōu)化總?cè)坪康臏y定方法及確定不同生長年限和干燥溫度對黔產(chǎn)青錢柳品質(zhì)的影響[24]，為當(dāng)?shù)厍噱X柳的產(chǎn)地加工以及青錢柳類茶劑、酒劑產(chǎn)品的等級劃分提供依據(jù)和理論支撐，也為以青錢柳為原料的保健食品、特醫(yī)食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?試劑。

齊墩果酸對照品（上海金穗生物科技有限公司，批號20160511）;無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號60160401）;高氯酸（川東化工，批號20130603）;冰醋酸（柳州市登榜貿(mào)易有限公司，批號20151011）;乙酸乙酯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20150305）;石油醚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20160718）;香草醛（上海譜振生物有限公司，批號20150305）。

1.1.2?樣品。青錢柳采收于貴州省雷山縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)葉世蕓教授鑒定為青錢柳（Cyclocarya?paliurus）。將葉片去除雜質(zhì)，分別采用25（室溫陰干）、60、70、80、90、100?℃恒溫干燥箱干燥，粉碎，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3?儀器與設(shè)備。

紫外光譜儀（日本島津，型號UV2501PC）;電子天平（瑞士梅特勒公司，型號XS205）;分析天平（上海梅特勒，型號AB204-S）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠，型號HH-4）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津天泰儀器有限公司，型號101-1A）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ-100E）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?齊墩果酸對照品溶液的配制。

取齊墩果酸對照品適量，精密稱定，置于100?mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶液進(jìn)行定容，搖勻，濃度為0.205?0?mg/mL，備用。

1.2.2?供試品溶液的制備方法。

取青錢柳樣品約0.5?g，精密稱定，置于索氏提取器中，加入石油醚，在70?℃水浴中脫脂?3?h，脫脂完成后，將濾渣自然風(fēng)干后置于圓底燒瓶中，精密加入30?mL的70%乙醇溶液，稱定重量后，置超聲波清洗器中超聲提取40?min后取出，用70%乙醇補(bǔ)足重量，過濾，取續(xù)濾液即得青錢柳樣品溶液。

1.2.3?顯色方法。精密量取供試品溶液?0.2?mL，置于10?mL試管中，水浴蒸干，用移液管吸取5%香草醛-冰醋酸溶液?0.2?mL?和高氯酸溶液0.8?mL加入試管中，搖勻，在60?℃水浴中加熱15?min，取出，迅速冷卻后加入4?mL冰醋酸，并用70%的乙醇定容至10?mL，搖勻，即得。

2?結(jié)果與分析

2.1?檢測波長

精密量取一定量的齊墩果酸對照品溶液及

供試品溶液，按“1.2.3”方法顯色，用紫外光譜儀在200～?800?nm?波長掃描[25]，確定最大吸收波長為546.5?nm（圖1）。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取齊墩果酸對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?mL，置于試管中水浴揮干，同時(shí)進(jìn)行顯色處理，在546.5?nm處測定其吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸對照品溶液的濃度在0.004?1～0.024?6?mg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=52.864x-0.092?3（r=0.999?7）。

2.3?樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

取脫脂后的青錢柳粉適量，精密稱定，將濾渣自然風(fēng)干后置于圓底燒瓶中，按通過單因素考察的水平，以表1的條件處理樣品，結(jié)果見表2。

經(jīng)方差分析，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度對含量測定結(jié)果有顯著影響（F=5.148，P=0.043<0.05），通過極差和因素指標(biāo)分析，確定最佳的料液比和超聲時(shí)間并經(jīng)驗(yàn)證，最終得出最佳的提取條件為：料液比為1∶30，70%乙醇溶液，超聲提取40?min。

2.4?穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣品適量，按“1.2.2”方法處理樣品，按“1.2.3”方法進(jìn)行顯色，分別于0、5、10、15、20、25?min連續(xù)測定6次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸光度的RSD為0.30%（n=6），表明樣品在25?min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5?精密度試驗(yàn)

精密量取“1.2.1”項(xiàng)下對照品適量，按?“1.2.3”方法顯色，測定吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸光度的RSD為?0.27%，表明儀器的精密度良好。

2.6?重復(fù)性試驗(yàn)

取6份青錢柳，精密稱定，分別按“1.2.2”方法處理樣品，按“1.2.3”方法進(jìn)行顯色，測定吸光度，結(jié)果見表3，吸光度的RSD為2.47%，表明該試驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好。

2.7?加樣回收試驗(yàn)

取已知總?cè)坪康乃幉?份，精密稱定，加入與已知藥材中總?cè)葡喈?dāng)量的齊墩果酸，再按?“1.2.2”方法處理，按“1.2.3”方法進(jìn)行顯色，測定吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），平均回收率為99.55%，RSD為2.24%，表明該試驗(yàn)方法可靠。

2.8?樣品的測定?將不同生長年限、不同干燥溫度下的60份青錢柳，按“1.2.2”方法處理，按“1.2.3”方法進(jìn)行顯色，測定吸光度并計(jì)算總?cè)坪?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表5），不同干燥溫

度和生長年限對黔產(chǎn)青錢柳中總?cè)坪康挠绊懢哂酗@著性差異，干燥溫度在80℃時(shí)，總?cè)频暮扛哂谄渌谥茰囟认碌摹?/p>

通過方差分析，干燥溫度F=8.875、P=0.00<0.05，生長年限F=12.841、P=0.000<0.05，所以干燥溫度和生長年限對青錢柳中總?cè)频暮坑酗@著影響。?對60份樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，低溫和高溫會使青錢柳中的總?cè)坪孔兊?，而最佳的干燥溫度?0?℃，結(jié)果見圖2。分別對干燥溫度和生長年限總?cè)坪康木颠M(jìn)行聚類分析，陰干和100?℃，60、70和90?℃，80?℃聚為3類，而生長年限對總?cè)坪康挠绊憻o規(guī)律可尋，結(jié)果見圖3。但從加工過程可以觀察到，樣品的生長年限越長，葉片硬度越大，會造成葉片碎裂，難以成型，最佳的是3～7年生的青錢柳。

3?結(jié)論與討論

該研究測定黔產(chǎn)青錢柳在不同炮制溫度及不同生長年限下總?cè)坪康淖兓?，以確定青錢柳產(chǎn)地加工的最佳溫度和生長年限對其品質(zhì)影響的差異。通過正交試驗(yàn)，確定樣品用30倍量的70%乙醇，超聲提取40min，顯色后，在546.5?nm的波長下測定其吸光度。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測定60批青錢柳樣品總?cè)频暮?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同干燥溫度和生長年限對黔產(chǎn)青錢柳中總?cè)坪康挠绊懢哂酗@著差異，干燥溫度在80℃時(shí)，總?cè)频暮扛哂谄渌谥茰囟认碌?，并且高溫和低溫條件下，青錢柳的色澤加深，影響到成品的外觀性狀。青錢柳的最佳干燥溫度為80℃，由于不同生長年限中總?cè)坪康牟町悷o規(guī)律可尋，有待進(jìn)一步研究確定。

黔產(chǎn)青錢柳野生資源豐富，歷史悠久，民間多以青錢柳茶飲，以初春嫩葉為原料，經(jīng)過炒制而成[26]。茶飲氣清香、味甘甜、色澤呈紅棕色，具有生津止渴、清熱解暑的功效，特別適宜于現(xiàn)代三高類慢性疾病人群的飲用[27-28]。隨著貴州省青錢柳種植面積的擴(kuò)大，青錢柳的采摘和產(chǎn)地加工亟待解決，吳琳琳等[29]采用中藥指紋圖譜的方法，對青錢柳的10個采收期進(jìn)行研究，確定的最佳采收期在8月末和9月初。通過對當(dāng)?shù)厍噱X柳種植基地的調(diào)研，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民僅憑借經(jīng)驗(yàn)，青錢柳在清明節(jié)前后采摘，原因是這個季節(jié)采摘的葉片破碎率低、干燥率高、容易加工。用傳統(tǒng)炒茶機(jī)加工青錢柳，對原料的含水量和硬度要求較高，經(jīng)過篩選后加工會造成青錢柳資源的浪費(fèi)，而且加工溫度不易控制，會影響產(chǎn)品質(zhì)量。該研究以總?cè)频暮繛橹笜?biāo)，對不同生長年限的青錢柳在不同干燥溫度下加工，并考察其對成品性狀的影響，以解決青錢柳的產(chǎn)地加工問題。

貴州省建立了青錢柳種植基地，隨著青錢柳面積種植的擴(kuò)大化，青錢柳的規(guī)范化種植、產(chǎn)地加工等技術(shù)亟待解決。青錢柳的產(chǎn)地炮制溫度就是其影響品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)之一，該研究結(jié)果可以作為青錢柳產(chǎn)地加工的技術(shù)支撐，也為以后加工設(shè)備參數(shù)的設(shè)定提供理論依據(jù)。青錢柳于冰川世紀(jì)保存至今，是國家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一[30]?，但在對貴州省青錢柳種植基地進(jìn)行資源考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于加工設(shè)備的落后，導(dǎo)致生長年限較久的葉子無法加工，造成大量的稀缺資源的浪費(fèi)。該研究也對不同生長年限的青錢柳的質(zhì)量進(jìn)行了初步探討，結(jié)果無規(guī)律可尋，所以有待進(jìn)一步研究。

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