田守蔚 姜臨建 崔霞霞 張潔 郭紹貴 李茂營(yíng) 張海英 任毅 宮國(guó)義 宗梅 劉凡 陳其軍 許勇

目的與意義：草害嚴(yán)重威脅了西瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)，然而在中國(guó)注冊(cè)的西瓜除草劑只有5種，且對(duì)闊葉雜草控制效果較差，因此急需有效的瓜田雜草控制方案。培育抗除草劑西瓜新品種是解決西瓜田間草害的有力措施，但依靠傳統(tǒng)的育種手段幾乎無(wú)法實(shí)現(xiàn)。因此，筆者希望利用CRISPR/Cas9單堿基編輯技術(shù)對(duì)西瓜ALS基因（編碼乙酰乳酸合成酶，植物支鏈氨基酸生物合成關(guān)鍵酶）190位的脯氨酸位點(diǎn)進(jìn)行編輯，獲得具有抗ALS類除草劑的西瓜新種質(zhì)，為西瓜田闊葉雜草的控制提供有效的技術(shù)方案。

材料與方法： 將包含西瓜ALS基因190位點(diǎn)的gRNA構(gòu)建至CRISPR/Cas9單堿基編輯載體pBSE901中，其中BE3（第三代單堿基編輯器）由2個(gè)35S啟動(dòng)子啟動(dòng)（原圖1-b），可以在西瓜基因組靶點(diǎn)處3～9 bp的位置實(shí)現(xiàn)C堿基的改變（原圖1-a）。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至西瓜ZG94的子葉。陽(yáng)性再生植株通過(guò)膠體金免疫分析試紙及Sanger測(cè)序鑒定。

結(jié)果與分析：（1）單堿基編輯效率達(dá)23%：T0代共獲得199株陽(yáng)性株，測(cè)序結(jié)果表明，有45株發(fā)生C至T突變，表明單堿基編輯效率高達(dá)23%。其中有34株僅在第7位發(fā)生C至T轉(zhuǎn)換，另外11株植株在位置7和8均發(fā)生了C至T的轉(zhuǎn)換（原圖1-c）。（2）編輯位點(diǎn)穩(wěn)定遺傳：對(duì)T0代的株系1、4及6的T1代基因型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，后代分離過(guò)程中再次編輯的發(fā)生在很大程度上使等位基因分離復(fù)雜化，但結(jié)果清楚地表明點(diǎn)突變可以高效的遺傳給下一代。（3）T1獲得不含轉(zhuǎn)基因成分的抗性株：通過(guò)PCR、膠體金免疫分析試紙測(cè)試及草銨膦處理等多種檢測(cè)手段，來(lái)自株系1、4、6 T1代的7/24、6/20和4/19植株含有堿基編輯的等位基因但沒(méi)有BE3基因，這些植株在構(gòu)建的T-DNA區(qū)域不含bar基因翻譯的PAT蛋白，證明T1代即可獲得不含轉(zhuǎn)基因成分的P190S單堿基編輯純合株。（4）P190S除草劑抗性水平及生長(zhǎng)水平評(píng)估：?jiǎn)螇A基編輯獲得的P190S純合植株與野生型對(duì)照同時(shí)用苯磺?。ㄡ槍?duì)闊葉雜草控制非常有效的ALS類除草劑）處理。1 hm2 17 g苯磺?。╝i）處理后14 d，所有野生型植株都嚴(yán)重受損，P190S植株不受影響（原圖1-e），1 hm2 68 g處理純合P190S植株時(shí)發(fā)生輕微損傷，但在處理后30 d內(nèi)恢復(fù)正常生長(zhǎng)。P190S純合株的果實(shí)、種子大小及種子產(chǎn)量與野生對(duì)照沒(méi)有差異。

結(jié)? ? 論：成功建立了西瓜高效單堿基編輯體系，創(chuàng)制了不含轉(zhuǎn)基因成分的抗除草劑西瓜新種質(zhì)。這些無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的堿基編輯抗除草劑西瓜植株在遺傳學(xué)上與傳統(tǒng)誘變育種相同，且單堿基編輯點(diǎn)突變對(duì)西瓜正常生長(zhǎng)無(wú)不良影響，因此這種抗除草劑西瓜新種質(zhì)可以進(jìn)行田間應(yīng)用。本研究結(jié)果表明，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的單堿基編輯系統(tǒng)是改良西瓜種質(zhì)的強(qiáng)大工具。