紀(jì)高潔 張潔 張海英 孫宏賀 宮國(guó)義 史建廷 田守蔚 郭紹貴 任毅 沈火林 高俊平 許勇

目的與意義：乙烯在葫蘆科作物性別決定過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，乙烯合成酶基因ACS突變導(dǎo)致黃瓜和甜瓜雄花完全花同株性型產(chǎn)生，然而在西瓜雄花完全花同株性型產(chǎn)生過(guò)程中該基因是否具有同樣作用仍不清楚。通過(guò)對(duì)心皮原基特異表達(dá)的西瓜乙烯合成酶基因CitACS4進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，以期明確西瓜雄花完全花同株性型產(chǎn)生的原因，為西瓜的基因改良提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法：利用生物信息學(xué)方法鑒定出西瓜的ACS基因。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）從具有不同性型的25個(gè)西瓜種質(zhì)庫(kù)（包含19種雌雄同體，1種雌性系，5種雄花完全花同株）中擴(kuò)增CitACS4的基因組序列，進(jìn)行序列比對(duì)鑒定與雄花完全花同株性型共分離的SNP，利用該SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)dCAPs標(biāo)記。以雄花完全花同株系A(chǔ)KKZW（aa）和雌雄同株系XHB（AA）雜交構(gòu)建F2群體。進(jìn)一步利用酶活性檢測(cè)、組織特異性表達(dá)分析驗(yàn)證CitACS4基因在雄花完全花同株性型產(chǎn)生過(guò)程中的作用。

結(jié)果與分析： （1）同源性和結(jié)構(gòu)分析：在西瓜基因組鑒定得到8個(gè)ACS基因，其中CitACS4與甜瓜的CmACS-7基因在氨基酸水平上具有94%的序列一致性。CitACS4基因組全長(zhǎng)1 720 bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，編碼具有444個(gè)氨基酸的多肽。（2）多態(tài)性位點(diǎn)分析：從具有不同性型的25個(gè)西瓜種質(zhì)庫(kù)（包含19種雌雄同體，1種雌性系，5種雄花完全花同株）中擴(kuò)增了CitACS4的基因組序列。鑒定出G1477C的SNP與雄花完全花同株性型共分離，該突變?cè)跉埢?64處引起半胱氨酸（C）至色氨酸（W）的替換（命名為C364W）。（3）C364W替換與雄花完全花同株性型的相關(guān)性：以雄花完全花同株系A(chǔ)KKZW（aa）和雌雄同株系XHB（AA）之間的雜交構(gòu)建了F2群體，用于檢測(cè)C364W替換是否與雄花完全花同株性型相關(guān)。設(shè)計(jì)dCAPs標(biāo)記dCAPs_FspBI以檢測(cè)G1477C的多態(tài)性。440個(gè)F2子代群體的基因型分析顯示，獲得的107株雄花完全花同株性型植物與dCAPs_FspBI的aa基因型共分離，而剩余的333個(gè)后代中沒(méi)有表現(xiàn)為雄花完全花同株性型，表明a基因與C364W替換密切相關(guān)。（4）C364W突變對(duì)ACS酶活性的影響：ACS蛋白具有12個(gè)保守框，C364W位于保守框6中。ACS酶活檢測(cè)分析表明C364W突變降低了CitACS4的酶活性（原圖2-A）。CitACS4的三維建模表明C364殘基位于α-羧酸骨架中。在該模型中，半胱氨酸殘基具有巰基，其可能潛在地形成二硫鍵以維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。C364W替換可能破壞了CitACS4的穩(wěn)定性，隨后破壞了酶的活性。（5）CitACS4基因的表達(dá)分析：組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)CitACS4在雌花和完全花中特異性表達(dá)（原圖2-B）。RNA原位雜交分析顯示，在stage5和stage6，CitACS4在雌性和完全花花蕾的心皮原基中特異性表達(dá)（原圖2-C～D），而在雄性花蕾中未檢測(cè)到表達(dá)（原圖2-E）。CitACS4表達(dá)模式與黃瓜CsACS2和甜瓜CmACS-7基因相類似。

結(jié)? ? 論： 西瓜中的雄花完全花同株性型是由CitACS4中的隱性突變引起的。CitACS4編碼的乙烯合成酶在雄花完全花同株性型西瓜中的活性受損，這可能使心皮原基中乙烯產(chǎn)生減少進(jìn)而導(dǎo)致雄花完全花同株性型產(chǎn)生，該結(jié)果將來(lái)可應(yīng)用于西瓜育種和遺傳改良。