邱勁軍 朱鵬 戴勇 曾啟昂 王凱 李鳳艷

1深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院（廣東深圳518118）；2深圳市人民院（廣東深圳518020）；3河南大學(xué)護理與健康學(xué)院（河南開封475000）

IgA 腎病是一種比較常見的腎小球疾病，其免疫病理特點主要是IgA 免疫復(fù)合物附著于腎小球系膜區(qū)［1］。在我國，原發(fā)性腎小球疾病患者中約半數(shù)是原發(fā)性IgA 腎病［2］。多數(shù)患者患病10～20年最終發(fā)展成為終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）［3］。IgA 腎病臨床表現(xiàn)差異比較大且缺乏特異性的治療方法，導(dǎo)致IgA 腎病治療困難、預(yù)后效果差。IgA 腎病的診斷現(xiàn)在主要依靠腎活檢技術(shù)即組織病理學(xué)免疫病理分析［4］。腎活檢是有創(chuàng)傷性的技術(shù)操作，存在一定的風(fēng)險性。據(jù)統(tǒng)計，腎活檢出血者比例高達1/5，少數(shù)患者由于采樣引發(fā)并發(fā)癥需要手術(shù)止血甚至行腎切除術(shù)［5］。而且，無癥狀的單純鏡檢血尿患者是否需要腎活檢也存在爭議。因此，探索IgA 腎病的發(fā)病機制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點，有利于改善IgA腎病診斷有風(fēng)險、治療難和預(yù)后差的狀況。

近年來，表觀遺傳學(xué)在疾病發(fā)病機制研究中的作用逐漸受到關(guān)注。表觀遺傳修飾不改變基因編碼信息，通過環(huán)境因素和細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的相互作用影響基因的表達和改變表觀遺傳性狀，其主要方式包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、微小RNA 等修飾［6］。作為一種重要且穩(wěn)定的表觀遺傳修飾，DNA 甲基化在調(diào)控基因表達、維持基因穩(wěn)定性、胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，與發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生都有密切的關(guān)系［7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，原核生物中N6-甲基腺嘌呤甲基化修飾能調(diào)控DNA 復(fù)制、修復(fù)、基因表達等重要的過程。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，6mA）修飾是DNA 腺嘌呤堿基第6 位N 原子上存在的甲基化修飾。最新報道發(fā)現(xiàn)，6mA 在真核生物中也比較普遍存在，而且承擔(dān)著重要的生物學(xué)功能。已有幾篇研究論文揭示了真核生物如綠藻、線蟲和果蠅基因組中存在6mA的修飾，因此其功能和調(diào)控機制引發(fā)了研究者更多的關(guān)注［7-9］。目前，關(guān)于6mA 修飾在IgA 腎病發(fā)病機制中的研究尚未見報道。隨著第二代測序技術(shù)日臻發(fā)展和成熟，免疫共沉淀實驗與高通量測序的整合（immunoprecipitation sequencing，IP-Seq），可在全基因組范圍對蛋白結(jié)合的位點進行高效而準(zhǔn)確的篩選與鑒定，同時也為研究的深入開展奠定基礎(chǔ)。本研究通過使用N6-甲基腺嘌呤抗體富集高甲基化的DNA 片段，將富集的DNA 甲基化區(qū)域進行高通量測序，通過生物信息學(xué)分析IgA 腎病患者和健康者之間的腺嘌呤甲基化修飾模式的差異，深入探討IgA 腎病的發(fā)生、發(fā)展機制，進而為IgA 腎病的診斷和治療尋找新靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年6月至2018年4月，中國人民解放軍第九二四醫(yī)院腎病中心收治的原發(fā)性IgA 腎病患者10 例（經(jīng)組織病理學(xué)免疫病理分析確診），其中男6 例，女4 例，年齡（41.8 ± 12.1）歲，所有患者在腎活檢時均未長期服用糖皮質(zhì)激素和（或）免疫抑制劑。健康對照者10 例，其中男6 例，女4 例，年齡（43.7 ± 10.3）歲，參與者均無高血壓、糖尿病、慢性腎炎病史，均無蛋白尿。抽取每例IgA 患者和健康者空腹外周靜脈血1 ～2 mL，EDTA抗凝后置于-80 ℃保存。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與者簽訂知情同意書。

1.2 DNA 樣本制備將樣本分為IgA 腎病組（編號為B01）和正常對照組（編號為N01）兩組樣本。分別取適量的血樣品，用DNA 提取試劑盒。采用NanoDrop 2000 微量分光光度計檢測純度（OD260/OD80=1.8～2.0）；Qubit 熒光光度計檢測濃度（≥1 ng/μL）；瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度1%、電壓120 V、時間45 min）檢測DNA 完整性（100～500 bp）。

1.3 建庫和測序隨機打斷DNA，將一部分DNA作為比對（Input），一部分DNA 用來免疫共沉淀（IP），采用anti-6mA antibody 進行免疫共沉淀反應(yīng)特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA 片段，對共沉淀獲得的目標(biāo)序列末端修復(fù)，加堿基A、加測序接頭，進行PCR 擴增，最后進行片段篩選獲得目標(biāo)長度的6mA-IP-seq 文庫，可得B01input、B01IP、N01input 和N01IP 4 個文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過文庫質(zhì)控合格后，進行測序。HiSeq 測序所得序列，通過去低質(zhì)量、去接頭等過程完成數(shù)據(jù)處理得到可信的目標(biāo)序列，將過濾后的目標(biāo)序列用于后續(xù)的分析。筆者對原始序列進行過濾，得到高質(zhì)量的Clean Reads，再進行后續(xù)分析。

1.4 生物信息學(xué)分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）進行富集分析：基因本體（gene ontology，GO）分析對甲基化明顯差異的基因分別進行分子功能、生物學(xué)過程、細胞組分富集；KEGG 進行信號通路分析，將分析結(jié)果進行Fisher 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IP-Seq 分析結(jié)果Peaks 是6mA的分布熱點，Peaks的顯著程度代表Peaks 可信程度的指標(biāo)，pvalue 越小顯著性越大。Peaks 數(shù)目用-LOG10（qvalue）計算，本此實驗共測得IgA 腎病組61 465個6mA 位點（peaks）的-Log10（qvalue）＞20，見表1、圖1A。6mA的熱點（peaks）主要分布在基因上游2K、5-UTR、外顯子、內(nèi)含子、3-UTR、下游2K 和基因間區(qū)，其中內(nèi)含子上分布最多，見圖1B。6mA表達上調(diào)基因有2 550 個，6mA 表達下調(diào)基因有1 563 個，見圖1C。

2.2 差異甲基化基因的GO 富集分析和KEGG信號通路分析結(jié)果

2.2.1 差異甲基化基因的GO 富集分析利用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫對差異基因進行GO 分析發(fā)現(xiàn)，其中包括生物過程，細胞成分和分子功能，見圖2。

甲基化差異基因主要涉及分子功能包括蛋白激酶抑制劑的活動、蛋白激酶C 抑制劑活性、N，N-二甲基苯胺單氧酶的活性、核酸綁定、酶抑制劑的活動、脫氧核糖核苷激酶活性、凝血酶受體的活動、菲醌-環(huán)氧化物水解酶活性、核內(nèi)小RNA 綁定、序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性、生長激素受體結(jié)合、限制脫氧核糖核酸內(nèi)切酶活性等，見表2。

表1 IgA 腎病患者和正常對照者的Peaks 掃描結(jié)果Tab.1 The Peak calling results of IgAN and NC

差異基因主要富集在線粒體電子傳遞、調(diào)節(jié)肽酶活性、調(diào)節(jié)磷酸的運輸、對雌激素的刺激做出反應(yīng)、正調(diào)節(jié)ATP 生物合成的過程、正調(diào)節(jié)核苷代謝過程、腎元小管形態(tài)發(fā)生、腎元上皮細胞形態(tài)發(fā)生、呼吸電子傳遞鏈、正調(diào)節(jié)有絲分裂細胞周期階段過渡、軟骨聚合、腎小管形態(tài)發(fā)生、反應(yīng)流體剪切應(yīng)力等生物學(xué)過程，見表3。

圖1 IP-Seq 分析結(jié)果Fig.1 IP-Seq analysis results

圖2 GO 聚類分析結(jié)果對比圖Fig.2 Comparison of GO classification

表2 差異基因的生物過程Tab.1 The list of biological processes

在細胞組成方面，差異基因主要涉及線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ、多囊腎蛋白復(fù)合體復(fù)雜、核常染色質(zhì)、細胞器內(nèi)膜、運動型的初級纖毛、抗肌萎縮相關(guān)糖蛋白復(fù)合體、應(yīng)力纖維、IgM 免疫球蛋白復(fù)合體、肌動蛋白絲、信使核糖核蛋白復(fù)合體、γ微管蛋白小復(fù)合體、IgA 免疫球蛋白復(fù)合體、肌動球蛋白、染色體著絲粒核心區(qū)域、高爾基體相關(guān)的泡膜等細胞組件，見表4。

2.2.2 差異甲基化基因的KEGG 信號通路富集分析通過KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要富集在胞吞、刺激神經(jīng)組織配體-受體作用、鈣離子信號通道、粘著斑等通路，其中胞吞代謝途徑富集倍數(shù)最高，此通路中MHC、TGB1、PIP5K、PLD1、RAB、CLB 等基因的6mA 表達水平顯著下調(diào)，見表5 和圖3、4。

3 討論

IgA 腎病是國內(nèi)較常見的慢性腎臟疾病之一，由于其臨床表現(xiàn)多樣化，多數(shù)較隱匿，有些患者僅表現(xiàn)為單純鏡檢血尿或蛋白尿［5］。若能早期診斷IgA 腎病，從發(fā)病初期對其采取相應(yīng)的干預(yù)策略，多數(shù)IgA 腎病在治療后，系膜細胞增生、腎小球血管袢壞死、間質(zhì)纖維化程度均會緩解，從而避免ESRD的發(fā)生［9］。盡管腎活檢是診斷IgA 腎病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是對無癥狀的單純鏡檢血尿者行腎活檢仍存在非議，且可能因此造成不必要的損傷［5］。由于近年來高通量技術(shù)的快速發(fā)展，表觀遺傳修飾作為基因表達的重要機制逐漸被人們所認識，DNA 甲基化在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關(guān)注。目前關(guān)于甲基化的研究焦點主要集中在5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）甲基化修飾參與疾病的發(fā)生機制。大量研究［10-11］表明，基因HLA的5′-甲基胞嘧啶異常甲基化與腎細胞癌、腎病細胞瘤、I 型糖尿病腎病等腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最新研究［12］發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤的N6-甲基修飾在DNA 復(fù)制、修復(fù)、基因表達調(diào)控等方面發(fā)揮重要的功能。目前，關(guān)于6mA 修飾在IgA 腎病發(fā)病機制中的研究尚未見報道。筆者推測6mA 修飾可能與IgA 腎病有一定的相關(guān)性。本研究通過6mA-IPSeq技術(shù)繪制全基因組腺嘌呤甲基化水平的圖譜，深入了解IgA 腎病的發(fā)生、發(fā)展機制，可能為IgA 腎病的早期診斷、干預(yù)和治療帶來新的契機。

表3 差異基因的分子功能Tab.3 The list of molecular function

表4 差異基因參與細胞組成Tab.4 The list of cellular component

表5 差異基因的KEGG 富集通路列表Tab.5 The list of KEGG pathway richness

圖3 KEGG 信號通路富集圖Fig.3 Richness of KEGG pathway

圖4 胞吞信號通路圖Fig.4 Endocytosis signaling pathway

本研究應(yīng)用免疫共沉淀聯(lián)合高通量測序技術(shù)檢測到IgA 腎病組中6mA 位點61 465 個，其中上調(diào)基因2 550 個，下調(diào)基因1 563 個。從結(jié)果顯示，越長的染色體上分布的Reads 數(shù)目越多，且分布頻率越高。6mA 甲基化熱點（peaks）主要分布在基因上游2K、5-UTR、外顯子、內(nèi)含子、3-UTR、下游2K 和基因間區(qū)等七個區(qū)域，大部分6mA 分布在內(nèi)含子上。

從GO 分析結(jié)果來看，6mA 差異基因主要參與調(diào)控遺傳物質(zhì)DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、合成、修復(fù)及轉(zhuǎn)座等分子功能。近期研究［12］也曾報道，6mA 是一種存在比較廣泛的修飾，它在調(diào)控DNA 復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)錄中起著重要作用。而且，齊素文等［13］通過對15 例IgA 腎病患者和15 例健康人外周血單核細胞（PBMC）的H3K4 甲基化進行染色質(zhì)免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)IgA 腎病患者基因組蛋白H3K4 甲基化與健康對照組有顯著差異，H3K4 甲基化可激活基因轉(zhuǎn)錄。由此推斷，6mA 在IgA 腎病中也發(fā)揮調(diào)控遺傳物質(zhì)DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等作用。本實驗結(jié)果顯示，6mA 差異基因主要富集在調(diào)節(jié)腎小管和上皮細胞形態(tài)發(fā)生、ATP 生物合成的過程、細胞周期等生物過程。有研究證實klotho 基因啟動子超甲基化影響klotho 基因的表達異常，多名研究者在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)慢性腎臟疾病患者腎組織和PBMCklotho 基因啟動子甲基化水平的升高與腎小球濾過率及腎間質(zhì)纖維化有一定的關(guān)系［14-15］。腎小管上皮細胞是腎小管間質(zhì)最主要的固有細胞，細胞膜上有多種轉(zhuǎn)運蛋白，依賴ATP 供能介導(dǎo)物質(zhì)轉(zhuǎn)運，包括介導(dǎo)多種內(nèi)源性毒素和外源性化學(xué)物質(zhì)的排泄，從而避免組織受多種有毒物質(zhì)的侵害［16］。 IgA 腎病多伴有腎小管間質(zhì)損傷，嚴(yán)重的小管間質(zhì)損傷是病情快速進展并最終導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的重要原因［17］。本研究通過KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，6mA 甲基化差異基因主要富集在胞吞、刺激神經(jīng)組織配體-受體作用、鈣離子信號通道、粘著斑等通路，其中胞吞代謝途徑富集倍數(shù)最高，此通路中MHC、TNFRSF、CRHR2、FSHR、PTHR1、CALCR 等基因的6mA 表達水平顯著下調(diào)。SUI 等［18］通過比較膜性腎病患者和正常健康人的基因5mC 甲基化程度，從108 個差異基因中篩選出5 個與膜性腎病有關(guān)的基因，這5 個基因均表現(xiàn)為低甲基化。近年研究表明，在近端小管mega1in-cubilin 受體介導(dǎo)的胞吞作用可以重吸收腎小球濾過大部分的蛋白質(zhì)［19］。由本實驗結(jié)果推測，胞吞代謝途徑相關(guān)基因的6mA 表達異常可能導(dǎo)致胞吞作用無法重吸收腎小球濾過的蛋白質(zhì)。那么，IgA 腎病的發(fā)生、發(fā)展可能與胞吞功能失調(diào)有關(guān)，且可能與胞吞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路某些基因6mA 表達下調(diào)有關(guān)。由此，進一步推測6mA 甲基化在IgA 腎病病程中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，本研究利用免疫共沉淀實驗與高通量測序的整合技術(shù)，在全基因組范圍對IgA 腎病DNA N6-甲基腺嘌呤甲基化區(qū)位點進行篩選與鑒定，初步篩出了一系列與IgA 腎病相關(guān)的差異甲基化基因。在KEGG 信號通路中，胞吞信號通路富集倍數(shù)最高，此通路中MHC、TGB1、PIP5K、PLD1、RAB、CLB 等基因的6mA 表達水平顯著下調(diào)。這些基因6mA 表達失調(diào)可能與IgA 腎病的發(fā)生、發(fā)展有密切相關(guān)性。下一步將結(jié)合生物信息學(xué)篩選出可能有意義的基因，并對其甲基化程度及位點進行進一步的驗證，以期發(fā)現(xiàn)與IgA 腎病相關(guān)的基因，為IgA 腎病的預(yù)測和診斷提供新的思路和線索。