盧沛林 尹東亮 尹潤(rùn)龍 林志強(qiáng)

東莞市人民醫(yī)院普外科（廣東東莞523000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種具有高度轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)等特性的惡性腫瘤，其發(fā)病率較高，治療難度較大，占原發(fā)性肝癌的90%以上［1］。最新權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)肝癌發(fā)病率高居第三位，5年生存率僅為14.1%，遠(yuǎn)低于日本的60.3%和韓國(guó)的68.9%［2］。因此，尋找肝癌預(yù)后標(biāo)志物以及進(jìn)一步深入研究肝癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制，對(duì)肝癌預(yù)后判斷、治療策略選擇等均具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。配對(duì)相關(guān)同源框1（paired related homoeobox 1，PRRX1）是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因子，參與腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控。最近有研究顯示，PRRX1的異常表達(dá)與各種腫瘤的不良預(yù)后顯著相關(guān)，包括結(jié)腸癌［3］、乳腺癌［4］等。然而，PRRX1 對(duì)不同類型腫瘤的預(yù)后相關(guān)性截然不同。在結(jié)腸癌中PRRX1 高表達(dá)與患者預(yù)后差顯著相關(guān)［3］，而在乳腺癌［4］中則截然相反。然而，有關(guān)PRRX1 在肝癌中表達(dá)及其具體的臨床意義的研究鮮有報(bào)道。本研究首先檢測(cè)了PRRX1 蛋白在肝癌組織中表達(dá)情況，分析了其與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，然后在細(xì)胞水平研究了PRRX1 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，旨在為肝癌的治療和預(yù)后判斷提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本收集2011年5月至2013年1月期間在東莞市人民醫(yī)院腫瘤科收治并經(jīng)手術(shù)切除的65 例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者癌組織標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。其中男42 例，女23 例；年齡25～76 歲，平均55.4 歲；臨床病理TNM 分期為Ⅰ期18 例，Ⅱ期27 例，Ⅲ期15 例，Ⅳ期5 例。所有入選患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療或其他抗癌治療，且術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)肝細(xì)胞癌。本研究使用的臨床組織樣本均獲得患者同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞及主要試劑人肝癌細(xì)胞株SMMC 7721 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；PRRX1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pGMLV-PA1-PRRX1）構(gòu)建及慢病毒（2.5×108TU/mL）購(gòu)自吉滿生物科技（上海）有限公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天有限公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；PRRX1 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus 公司；MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin 和GAPDH 單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；PrimeScriptTM RT Reagent Kit 及SYBR?Green PCR Kit 購(gòu)自日本Ta-KaRa 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)肝癌組織中PRRX1蛋白表達(dá)所有標(biāo)本進(jìn)行均進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫水，3%H2O2封閉30 min，0.01 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖溶液高壓修復(fù)15 min，山羊血清室溫封閉30 min，滴加PRRX1 多克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后滴加生物素標(biāo)記二抗室溫靜置30 min，DAB 顯色3 min、蘇木素復(fù)染、封片，拍照觀察。根據(jù)細(xì)胞漿及細(xì)胞核出現(xiàn)的棕褐色顆粒樣染色細(xì)胞數(shù)目和染色強(qiáng)度判定陽(yáng)性表達(dá)情況。具體參考范丹等［5］評(píng)分方法：每個(gè)樣本在400 倍鏡下選擇10 個(gè)陽(yáng)性染色區(qū)域分別計(jì)算100 個(gè)腫瘤細(xì)胞，取其平均值計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：＜5%，0分；5%～25%，1分；25% ～50%，2 分；＞50%，3 分。染色強(qiáng)度判斷：淺黃色，1 分；深黃色，2 分；棕褐色，3 分?？傆?jì)分為二者計(jì)分之和，總計(jì)分≤2 為陰性或低表達(dá)，＞2分為陽(yáng)性或高表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及感染復(fù)蘇人肝癌SMMC7721細(xì)胞株于培養(yǎng)皿中并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC7721 細(xì)胞，以2 × 105/孔的密度接種于6 孔板中。設(shè)置對(duì)照組、空載組和過(guò)表達(dá)組，以復(fù)感染指數(shù)（MOI）值為50 加入感染培養(yǎng)基和病毒感染SMMC7721 細(xì)胞，感染8 h 后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，5 d 后采用qRT-PCR 和Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRRX1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，確定感染效率。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性調(diào)整3 組細(xì)胞濃度為2×103個(gè)/孔，各取100 μL 細(xì)胞懸液分別接種于96 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 和72 h。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm 處讀取OD值，細(xì)胞活力以測(cè)取得OD值表示。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中PRRX1 mRNA 表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。根據(jù)Prime-ScriptTM RT Reagent Kit 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板使用SYBR?Green PCR Kit 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)量。引物序列，PRRX1 上游：5′-GCACAGGCGGATGAGAAC-3′，下游：5′-TCTTCTGAGTTCAGCTGGTCAT-3′；GAPDH 上游：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游：5-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲時(shí)，需要提前將Matrigel 膠均勻平鋪于上室，制成凝膠；檢測(cè)細(xì)胞遷移時(shí)，上室不需要平鋪Matrigel 膠，其余步驟一致。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，上室接種200 μL 細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 10%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出下室，洗滌、加入40 g/L 多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，選取5 個(gè)隨機(jī)視野，統(tǒng)計(jì)視野中細(xì)胞數(shù)目，取平均值為侵襲或遷移的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 Western Blot 實(shí)驗(yàn)收集各組細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞裂解液，冰上充分裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min 離心25 min，收集上清，Bradford 法蛋白定量。取25 μg 蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h，加入適量ECL 超敏發(fā)光液，顯影。

1.2.7 隨訪對(duì)納入研究的肝癌患者進(jìn)行為期5年的隨訪，開始時(shí)間為患者接受手術(shù)切除后即可起，隨訪最終截止時(shí)間為2018年1月13日。隨訪方式為門診隨訪和電話隨訪相結(jié)合，平均每3 個(gè)月隨訪一次，患者死亡時(shí)間作為單個(gè)病例隨訪截止時(shí)間，中途失訪3 例，失訪患者按照存活病例納入生存分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)分析PRRX1 蛋白表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)相關(guān)性；采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，采用Logrank Test 進(jìn)行生存曲線間比較；運(yùn)用Cox 回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRRX1蛋白在肝癌中的表達(dá)情況及臨床病理特征分析免疫組化結(jié)果顯示，PRRX1 蛋白在細(xì)胞核及胞漿中均有表達(dá)（圖1）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，PRRX1蛋白在肝癌組織中的陰性表達(dá)率為73.85%（48/65），在癌旁組織中的陰性表達(dá)率為18.46%（12/65），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。臨床病理特征分析結(jié)果顯示，PRRX1 蛋白陰性表達(dá)率與患者年齡、性別、腫瘤大小、血清AFP 含量、HBsAg、anti-HCV、肝硬化、腫瘤數(shù)目等臨床病理特征參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），與血管侵犯、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和TNM 分期等臨床病理特征參數(shù)有顯著相關(guān)性（P＜0.05，表1）。Cox 回歸模型分析顯示血管侵犯、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和PRRX1 陰性表達(dá)可以作為肝癌患者獨(dú)立的生存預(yù)測(cè)因子（P＜0.05，表2）。

圖1 PRRX1 在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（×200）Fig.1 PRRX1 expression in hepatocellular carcinoma tissues and adjacent tissue（×200）

表1 PRRX1 蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Correlation of PRRX1 expression with the clinicopathological features of patients with hepatocellular carcinoma 例（%）

表2 Cox 回歸模型對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后參數(shù)的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of prognostic parameters in patients with hepatocellular carcinoma by Cox regression analysis

2.2 PRRX1 蛋白陰性表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier 分析顯示，PRRX1 蛋白低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間為22.5 個(gè)月，PRRX1 蛋白高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間為45 個(gè)月。Log-rank Test分析顯示，PRRX1 蛋白低表達(dá)患者5年生存率顯著低于PRRX1 蛋白高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。提示，PRRX1 低表達(dá)與肝癌患者預(yù)后差有一定的關(guān)聯(lián)。

圖2 PRRX1 蛋白表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Correlation of PRRX1 expression with the prognosis of patients with hepatocellular carcinoma

2.3 過(guò)表達(dá)PRRX1 對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721 活力的影響Western Blot 分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空載組比較，過(guò)表達(dá)組PRRX1 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖3A）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空載組比較，過(guò)表達(dá)組PRRX1 mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖3B）。提示，PRRX1 過(guò)表達(dá)的SMMC7721 細(xì)胞株構(gòu)建成功。采用CCK-8 技術(shù)檢測(cè)感染后細(xì)胞活力，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組在感染后48、72 h 時(shí)其細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組和空載組（P＜0.05，圖4）。

2.4 過(guò)表達(dá)PRRX1 對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721 侵襲與遷移能力的影響Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空載組比較，過(guò)表達(dá)PRRX1 可顯著抑制SMMC7721 細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.05，圖5）；同時(shí)，Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移能力顯著低于對(duì)照組和空載組比較（P＜0.05，圖6）。

圖3 PRRX1 蛋白和mRNA 在感染后SMMC7721 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 The expression of PRRX1 protein and mRNA in infected SMMC7721 cells

圖4 CCK-8 檢測(cè)感染后SMMC7721 細(xì)胞活力Fig.4 The cell viability of SMMC7721 cells after infection were detected by CCK-8 analysis

2.5 過(guò)表達(dá)PRRX1 對(duì)肝癌SMMC7721 細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空載組比較，過(guò)表達(dá)PRRX1可顯著下調(diào)MMP2、MMP9 以及間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin 等蛋白的表達(dá)，并且同時(shí)可上調(diào)上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)（P＜0.05，圖7）。

圖5 PRRX1 過(guò)表達(dá)對(duì)SMMC7721 細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）Fig.5 The effect of PRRX1 overexpression on the invasion ability of SMMC7721 cells（×200）

圖6 PRRX1 過(guò)表達(dá)對(duì)SMMC7721 細(xì)胞遷移能力的影響（×200）Fig.6 The effect of PRRX1 overexpression on the migration ability of SMMC7721 cells（×200）

圖7 PRRX1 過(guò)表達(dá)對(duì)MMP-2、MMP-9、E-cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 The effect of PRRX1 overexpression on the protein expression of MMP-2，MMP-9，E-cadherin and Vimentin

3 討論

PRRX1 基因位于人1q24.2 染色體上，其編碼的是一種由245 個(gè)氨基酸組成的分子量為27.3 kDa的小分子蛋白物質(zhì)，該蛋白通過(guò)增加血清反應(yīng)因子的DNA 結(jié)合活性起轉(zhuǎn)錄共激活的作用，可調(diào)節(jié)間充質(zhì)前體細(xì)胞的分化［6］。作為轉(zhuǎn)錄因子，PRRX1 基因可參與多種生理機(jī)制的調(diào)控。例如，已證實(shí)PRRX1 是一種新的EMT 誘導(dǎo)因子，并且與多種類型腫瘤患者預(yù)后相關(guān)［3-4］。

GUO 等［7］對(duì)125 例胃癌患者癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)PRRX1 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與腫瘤浸潤(rùn)的深度，EMT 標(biāo)志物蛋白Vimentin、N-cadherin 和β-catein 表達(dá)呈正相關(guān)性。TAKAHASHI 等［3］研究顯示，PRRX1 高表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后較差相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PRRX1 在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織，其表達(dá)水平與肝癌患者血管侵犯、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和TNM 分期等參數(shù)有顯著相關(guān)性，并且PRRX1 陰性表達(dá)肝癌患者5年生存率顯著低于PRRX1 陽(yáng)性表達(dá)肝癌患者。說(shuō)明，PRRX1在肝癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，并且患者預(yù)后差相關(guān)。這一研究結(jié)果與其他類型腫瘤中相關(guān)結(jié)果不一致，可能是由于腫瘤干細(xì)胞樣特性誘導(dǎo)所致。有研究顯示，由于干細(xì)胞樣特性誘導(dǎo)，PRRX1 在不同腫瘤中的表達(dá)和功能可能存在差異［8］。另外，ZHU 等［9］研究也顯示，在肺癌A549 細(xì)胞中抑制PRRX1 表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞樣特性的獲得，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT。進(jìn)一步證實(shí)，PRRX1 在肝癌中表達(dá)與其他類型腫瘤表達(dá)結(jié)果不一致，可能是由于在肝癌中PRRX1 低表達(dá)獲得了腫瘤干細(xì)胞樣特性所致。

EMT 是上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［10］。為了進(jìn)一步探討PRRX1 對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)PRRX1 過(guò)表達(dá)載體感染肝癌SMMC7721 細(xì)胞，成功構(gòu)建PRRX1 過(guò)表達(dá)的SMMC7721 細(xì)胞株。結(jié)果顯示，PRRX1 過(guò)表達(dá)可顯著抑制SMMC7721 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。提示，PRRX1 可能參與肝癌EMT的調(diào)控。E-cadherin 被認(rèn)為是上皮表型標(biāo)志物，Vimentin 則是間質(zhì)表型標(biāo)志物，二者表達(dá)變化被認(rèn)為是EMT 過(guò)程的標(biāo)志［11］。此外，MMP-2 和MMP-9 是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中重要成員，參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［12］。本研究結(jié)果顯示，PRRX1 過(guò)表達(dá)可顯著抑制Vimentin、MMP-2和MMP-9 等蛋白的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin 蛋白的表達(dá)。說(shuō)明，PRRX1 過(guò)表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞EMT 過(guò)程。提示，PRRX1 可抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。ZHU 等［9］研究也表明，PRRX1 缺失可通過(guò)上調(diào)N-cadherin、Vimentin 表達(dá)及下調(diào)E-cadherin 表達(dá)誘導(dǎo)肺癌A549 細(xì)胞發(fā)生EMT，從另外一面證實(shí)PRRX1 也可抑制肺癌A549 細(xì)胞EMT 過(guò)程。然而又有研究［13］表明，PRRX1 可通過(guò)調(diào)節(jié)EMT 促進(jìn)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。探究其原因，依舊可能是由于腫瘤干細(xì)胞樣特性誘導(dǎo)，導(dǎo)致PRRX1 在不同類型腫瘤細(xì)胞中表達(dá)和功能存在差異。

綜上所述，本研究證實(shí)PRRX1 在肝癌組織中低表達(dá)，其低表達(dá)與肝癌患者預(yù)后差相關(guān)，并進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討了PRRX1 過(guò)表達(dá)可抑制肝癌SMMC7721 細(xì)胞的侵襲、遷移及EMT，闡明PRRX1在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演的重要作用。該研究對(duì)PRRX1 抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制闡述還不夠透徹，且并未發(fā)掘PRRX1 在肝癌發(fā)展進(jìn)程中更多的功能，后續(xù)需要進(jìn)一步深入研究。